[发明专利]一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

说明书

本发明公开一种基因工程高产ε‑聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。本发明方法通过过表达苹果酸脱氢酶基因Mdh获得基因工程重组菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomyces diastatochromogenes MDH)，经过实验证实，该基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌TUST(CGMCC No.3145)生产ε‑聚赖氨酸的能力提高了17.96％，为ε‑聚赖氨酸生产提供了优良菌种。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine)和γ-聚谷氨酸是目前发现两种天然多聚氨酸。自1977年日本学者发现首株生产ε-聚赖氨酸菌株白色链霉菌(S.albulus)以来，后从土壤中筛选出多株具有生产ε-聚赖氨酸的菌株，其中大部分菌株属于链霉菌属(Streptomyces)和北里孢菌属(Kitasatospora)。ε-聚赖氨酸由25-35个赖氨酸的ε-氨基和α-羧基通过酰胺键连接而成。因其抑菌图谱广、水溶性好、热稳定性强，目前被广泛应用为食品防腐剂，还可用作化妆品、基因载体、药物包被物等。如：ε-聚赖氨酸为多阳离子聚合物，可与带电质粒利用静电吸附作用而形成基因复合物，可有效避免核酸酶降解；ε-聚赖氨酸和氨甲蝶呤形成复合物，在可以有效治疗白血病和恶性肿瘤的同时，并提高靶细胞对于氨甲蝶呤的吸收。目前于食品、医药、材料等领域均有极大的发展前景。

由于ε-聚赖氨酸有着优良的品质和良好的市场前景，关于提高ε-聚赖氨酸产量研究一直在开展。早期为提高ε-聚赖氨酸产量多从发酵工艺优化和诱变育种等方面出发。如2001年，Kahar等提出采用两阶段pH控制策略来提升S.albulus S410菌株ε-聚赖氨酸的产量；1988年日本Chisso公司以S.albulus No.346为出发菌株，经NTG和S-AEC为抗性筛选标记，获得一株较出发菌株产量提高3.3倍；而国内研究人员如李双双，吴振强等人就曾以白色链霉菌为初始菌株进行紫外和DES复合诱变，成功获得一株突变菌产量达到0.73g/L，比初始菌株提高2.2倍。而基于构建工程菌株提高ε-聚赖氨酸产量的方法则相对较少，尤其是通过过表达TCA循环关键酶苹果酸脱氢酶(Mdh)的方法未发现相关报道。

通过检索，发现如下与本发明专利申请相关的公开文献：

1.一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，较出发菌株有着更高的ε-聚赖氨酸合成能力。虽然工程菌的ε-聚赖氨酸合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了对于氮源等菌体生长物质的利用率，并无进一步提高代谢途径强度，因此小白链霉菌ε-PL产量仍有提升空间。

2.一株小白链霉菌基因工程菌株及其在ε-聚赖氨酸生产中的应用(CN111454873A)，公开了一株基因工程菌小白链霉菌(Streptomyces albulus)Q-PL2，它是将源于S.albulus Q-PL的聚赖氨酸合成酶(Pls)基因进行过表达处理，较出发菌株小白链霉菌野生菌Q-PL产量提高2-5倍，虽然ε-聚赖氨酸的生产能力有所提高，但该工程菌株主要强化单一代谢途径，而非多条代谢通路的提高，ε-PL的生产能力仍然有待提高。