[发明专利]高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途有效
| 申请号： | 202110597779.X | 申请日： | 2021-05-31 |
| 公开（公告）号： | CN113430155B | 公开（公告）日： | 2023-01-31 |
| 发明（设计）人： | 宋浩;房立霞;曹英秀 | 申请（专利权）人： | 天津大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/55;C12N15/90;C12N15/113;C12P7/40;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人： | 陆艺 |
| 地址： | 300350 天津市津南区海*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 高产 游离 脂肪酸 重组 大肠杆菌 菌株 及其 构建 方法 用途 | ||
1.高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将tesA’基因和dcas9基因连接到质粒YX212，构建重组质粒pCF；所述tesA’基因为大肠杆菌BL21(DE3)内源的截掉前导肽序列的硫酯酶基因的缩写；所述dcas9基因是酿脓链霉菌(Streptococcus pyogenes)来源的突变两个碱基的Cas9蛋白的编码基因的缩写；
所述tesA’基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述dcas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述YX212质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将质粒pCF转化到菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株CF；
(3)将靶向大肠杆菌BL21(DE3)内源基因ihfA的sgRNA表达盒ihfA-Low片段与Sg-S骨架片段酶切连接，构建重组质粒Sg-LihfA；
所述ihfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述ihfA-Low片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述Sg-S骨架片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用引物NdeI-aidB-F和NheI-aidB-R进行PCR扩增，得到片段NdeI-aidB-XhoI；将PBAD-T1片段和NdeI-aidB-XhoI片段依次连接到重组质粒Sg-LihfA，构建重组质粒Sg-LihfA-OaidB；
所述aidB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述NdeI-aidB-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述NdeI-aidB-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述PBAD-T1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(5)将靶向大肠杆菌BL21(DE3)内源基因ryfA的sgRNA表达盒ryfA-Medium片段连接到重组质粒Sg-LihfA-OaidB，构建重组质粒Sg-LihfA-OaidB-MryfA；
所述ryfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述ryfA-Medium片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
(6)将重组质粒Sg-LihfA-OaidB-MryfA转化到重组菌株CF中，得到高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株LihfA-OaidB-MryfA。
2.权利要求1的构建方法构建的高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株。
3.权利要求2的高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株合成游离脂肪酸的用途。
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