[发明专利]高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途，包括如下步骤：将tesA’和dcas9连接到YX212，构建质粒pCF并转化到菌株BL21(DE3)得到重组菌株CF；将ihfA‑Low、P_BAD‑T1、NdeI‑aidB‑XhoI和ryfA‑Medium依次连接到Sg‑S，构建质粒Sg‑LihfA‑OaidB‑MryfA，继续连入gadA‑High，构建质粒Sg‑LihfA‑OaidB‑MryfA‑HgadA，将两质粒分别转化到菌株CF得到重组菌株LihfA‑OaidB‑MryfA和LihfA‑OaidB‑MryfA‑HgadA；本发明菌株可高效合成游离脂肪酸。方法简便。

技术领域

本发明涉及生物合成和生物能源技术领域，更具体的说是涉及高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途。

背景技术

游离脂肪酸是一类重要的平台化合物，其衍生的烷/烯烃和脂肪酸酯比短链醇具有更高的能量密度，并且与汽油不存在10％～20％的混合壁垒，被认为是更有潜力的替代燃料；而其衍生的脂肪醇和三酰甘油等产品因具有优良的亲疏水性，也是洗涤剂、润滑剂、化妆品和药物等多种化学工业产品的主要原料。脂肪酸本身可以作为食品添加剂，塑化剂，橡胶成分和表面活性剂。

利用工程大肠杆菌高效地合成脂肪酸成为了近年来的研究热点。野生型大肠杆菌基本不生成游离脂肪酸，表达去掉前导肽的内源硫酯酶基因(tesA’)，可以将细胞内积累的脂酰-ACP转化为游离脂肪酸。大肠杆菌脂肪酸代谢过程如图1所示。通过过表达合成路径中的关键基因、敲除旁路代谢途径、上下游代谢模块的适配等代谢工程改造，工程大肠杆菌合成脂肪酸的产量取得了很大的进步。

但是，目前工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究多集中于对脂肪酸代谢路径相关基因的改造。由于细胞代谢过程的复杂性，仅扰动相关路径基因的表达并不能充分利用微生物细胞的生产潜力。因此，从细胞代谢网络中识别到其他可用的基因靶点并加以调控，将有助于改造工程细胞获得更高的目标产物的产出。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株。

本发明的第二个目的是提供一种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株合成游离脂肪酸的用途。

本发明的第四个目的是提供第二种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株。

本发明的第五个目的是提供第二种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明的第六个目的是提供第二种高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株合成游离脂肪酸的用途。

本发明的技术方案概述如下：

高产游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将tesA’基因和dcas9基因连接到质粒YX212，构建重组质粒pCF；所述tesA’基因为大肠杆菌BL21(DE3)内源的截掉前导肽序列的硫酯酶基因的缩写；所述dcas9基因是酿脓链霉菌(Streptococcus pyogenes)来源的突变两个碱基的Cas9蛋白的编码基因的缩写；

所述tesA’基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述dcas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YX212质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将质粒pCF转化到菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株CF；

(3)将靶向大肠杆菌BL21(DE3)内源基因ihfA的sgRNA表达盒ihfA-Low片段与Sg-S骨架片段酶切连接，构建重组质粒Sg-LihfA；