[发明专利]一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及肿瘤靶向系统，具体涉及一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡。本发明将抗‑REDD1 siRNA与化疗药物共同负载于同一细菌外泌囊泡，靶向递送至肿瘤区域，通过肿瘤部位酸性微环境敏感释放细胞毒药物达到抑制肿瘤生长的目的；同时，抗‑REDD1 siRNA由甘露糖介导被M2型肿瘤相关巨噬细胞摄取，调节巨噬细胞代谢，最终实现免疫调节，血管重塑和抑制肿瘤转移的效果。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及肿瘤靶向系统，具体涉及一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡。

背景技术：

研究显示，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)占肿瘤细胞总数的50％以上，在肿瘤的进展和侵袭中起着重要作用。作为肿瘤发展的双刃剑，所述TAM存在两种表型，包括抗肿瘤M1型(TAM1)和促进肿瘤M2型(TAM2)。随着肿瘤进展M2型TAM被肿瘤细胞分泌的细胞因子募集，作为回报，TAM2可产生大量促进肿瘤细胞因子抑制抗肿瘤CD8+T细胞的浸润和功能，诱导血管生成，促进肿瘤细胞增殖和转移。因此通过调节TAM极化重塑肿瘤免疫微环境已成为本技术领域的一种新的治疗策略。有研究者开发了多种药物实现TAM选择性极化和疗效，包括瑞戈非尼，唑来膦酸和核酸药物，例如miR-155等。

一般认为，肿瘤相关巨噬细胞的表型与其代谢表型相关，M1型巨噬细胞糖酵解代谢水平提高，M2型巨噬细胞脂肪酸氧化水平升高。近期有研究发现，肿瘤细胞通过营造乏氧和代谢高压的肿瘤微环境促进巨噬细胞表达的REDD1上调，从而下调其糖酵解水平，减少其与肿瘤细胞，新生血管上皮细胞的代谢竞争，促进肿瘤生长和转移。通过下调REDD1则可以上调肿瘤部位的巨噬细胞的糖酵解水平，增加其葡萄糖摄取，增加其代谢竞争能力，从而抑制肿瘤生长和转移。

有研究认为，肿瘤微环境代谢压力较大，通过微酸环境响应释放的化疗药物同时直接杀伤肿瘤细胞，阻断巨噬细胞与肿瘤细胞的代谢对话，能起到更好的协同抗肿瘤作用。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种肿瘤靶向系统，具体涉及一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡。

发明内容：

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种肿瘤靶向系统，具体涉及一种肿瘤相关巨噬细胞代谢调节和肿瘤杀伤协同作用的细菌外泌囊泡，该肿瘤靶向系统组成特征为细菌外泌囊泡载体、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通过顺乌头酸酐修饰的紫杉醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-甘露糖、抗-REDD1siRNA构成。

本发明的实施例中，提供了制备方法，

其中，制备顺乌头酸酐修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-紫杉醇：

称取顺乌头酸酐溶于无水二氯甲烷中于两口瓶，在0℃冰浴搅拌下向瓶中逐滴加入溶于40μLDMF的草酰氯，搅拌后转移至室温，继续反应后旋蒸除去未反应的草酰氯。重新将体系溶于无水二氯甲烷，加入紫杉醇，和吡啶，室温搅拌反应后加入饱和氯化铵水溶液终止反应，分液取有机层在冷的正己烷中沉淀以得到产物顺乌头酸酐修饰的紫杉醇；取上述产物溶于DMSO后加入DSPE-PEG和微量二甲基氨基吡啶，在氩气保护下在35℃反应24到48小时后使用3500Da的透析袋在在DMSO中透析24小时后更换为纯水继续透析48小时后冻干以获得最终产物。

本发明的实施例中，提供了制备M-OMV-CA-PTX@siRNA纳米囊泡的制备方法：siRNA以每10⁹个囊泡加入1μg siRNA后在400mV使用电转仪进行电转以制备OMV@siRNA外泌囊泡溶液，

上述顺乌头酸酐修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-紫杉醇以紫杉醇质量计量，加入OMV@siRNA外泌囊泡溶液中，使其紫杉醇终浓度为4mg/mL.同时加入甘露糖修饰的DSPE-PEG使其终浓度为0.1mg/mL。涡旋后经循环的30秒超声和30秒暂停后，囊泡保温于37℃孵育恢复稳定形态后进行后续鉴定和表征。