[发明专利]一种无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法

说明书

本发明提供了一种无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法，无菌菠萝外植体制备方法包括将菠萝幼嫩植株先用清水冲洗干净，然后通过75％的酒精和0.1％HgCl₂分别进行消毒后，通过菠萝不定芽诱导培养基诱导菠萝不定芽的产生，产生的不定芽转移至不定芽扩繁培养基上继续光照培养，得到无菌菠萝植株，无菌菠萝植株转移至壮苗培养基上继续光照培养，得到较为粗壮的无菌菠萝植株，将其切成约3mm左右厚度的茎圆片，可以用于菠萝农杆菌转化。该方法通过优化外植体消毒方法得到无菌植株，通过不定芽途径得到大量菠萝茎圆片，并在茎圆片的基础上进行菠萝的转化，提高了菠萝的转化效率；该方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种无菌菠萝外植体制备方法及其农杆菌转化方法。

背景技术

菠萝(Ananas comosus)，是热带和亚热带第三重要的水果作物，仅次于香蕉和柑橘。菠萝原产于南美洲巴西、巴拉圭的亚马逊河流域一带，16世纪从巴西传入中国。现在已经流传到整个热带地区。菠萝作为鲜食，甜酸适口，清脆多汁。菠萝除鲜食外，多用以制罐头，因其能保持原来风味而受到广泛喜爱。加工制品菠萝罐头被誉为“国际性果品罐头”，还可制成多种加工制品，广受大众欢迎。叶的纤维较为坚韧，可供用于织物、制绳、结网和造纸。

虽然通过自交不亲和单子叶植物物种杂交已经广泛的用于生产改良植物品种，但是高水平基因组杂合性与基因组不稳定性，导致用这种方法改良植物品种是很难的。通过转基因技术进行改良植物品种对解决各种农业、农艺问题有着巨大的潜力。转基因抗除草剂菠萝、解决早熟开花转基因菠萝等菠萝转化的成功，证明通过植物基因工程技术是可行而且高效的，因此找到一种稳定高效的用于菠萝转基因的方法，对菠萝新品种开发和基因功能的研究有非常重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种实施可靠、制备便利的无菌菠萝外植体制备方法以及简便、高效的农杆菌转化方法，

为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种无菌菠萝外植体的制备方法，包括：将菠萝植株消毒后切块，并放在菠萝不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，得到的不定芽继续培养成无菌菠萝植株，从无菌菠萝植株基部切下茎圆片，作为无菌菠萝外植体。

进一步的，所述菠萝植株为幼嫩的菠萝植株；将其冲洗干净后在无菌环境中对其进行消毒处理。

进一步的，所述菠萝植株的消毒处理步骤包括：先用75％的酒精消毒30秒，无菌水清洗3～5次，再用0.1％的HgCl₂消毒6-8min，无菌水清洗5次以上，每次清洗时间大于1min。

进一步的，经消毒处理后的菠萝植株用无菌滤纸吸干水分，并将消毒好的菠萝植株切成0.4～0.8cm的块状，放置在菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N上，26℃温度条件下，光照培养20～30天，获得菠萝不定芽。

进一步的，将得到的不定芽转移至MS液体培养基培养基上，26℃温度条件下，光照继续培养20～30天，获得无菌菠萝幼株；将菠萝幼株继续转移至液体PM培养基上，26℃温度条件下，光照继续培养14天，获得无菌菠萝植株。

进一步的，在超净台中从基部开始横切2-4mm厚度的茎圆片2-3片，作为无菌菠萝外植体。

进一步的，所述菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，6-BA 3mg/L，NAA 0.2mg/L；其pH为5.6-5.8。

其中，菠萝愈伤组织诱导培养基3B0.2N的成分混合方案之一如下：将含有MS4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6-BA3mg/L，NAA 0.2mg/L。