[发明专利]应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法

说明书

本发明提供了一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法。其中界面包括气液界面以及二维膜(蛋白质二维晶体膜、石墨烯膜以及超薄碳膜等)与液体形成的界面，其步骤包括：设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；其中，在冷冻电镜样品制备过程中，在载网液膜的上界面或/和下界面应用电荷进行界面电荷修饰和界面电荷的改变。本发明提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，能够解决传统冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、不吸附样品颗粒以及取向优势等问题。

技术领域

本发明涉及透射电镜样品制备技术领域，特别涉及一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法。

背景技术

单颗粒冷冻电镜方法需要包埋在薄玻璃态冰层中的样品颗粒分布均匀且取向随机。然而，冷冻样品制备过程中形成的超薄液膜，其上下界面却常常不吸附样品颗粒，或者导致嵌在玻璃态冰中的样品颗粒出现取向优势问题，成为冷冻电镜高分辨结构解析的主要障碍之一。

冷冻样品制备过程中形成的超薄液膜，其上下界面包括气液界面以及二维膜/溶液界面。其中二维膜包括石墨烯膜，氮化硼膜，超薄碳膜等。

目前对于解决冷冻电镜样品制备过程中气液界面导致的取向优势问题，都是基于气液界面的疏水性质，采用的方法如下：

利用去污剂分子特殊的双亲性结构，帮助占据气液界面，从而去改善蛋白的取向优势问题。但该方法存在的缺点是只有特定的去污剂对改善取向优势问题才有效，而且筛选过程费时费力，成功率较低。还有的方法是利用超快冻样仪系统，在蛋白颗粒被气液界面捕获之前将其冷冻，但结果显示，即使冷冻样品制备的时间缩短至6ms，也不能使蛋白颗粒远离气液界面，还需要更多的证据证明超快冻样仪的有效性。上述方法都是使样品颗粒远离气液界面，而如果蛋白颗粒不吸附于气液界面，往往需要很高的制样浓度，而且冰层很难制薄。

另外，也有方法在载网孔内铺连续超薄碳膜以及石墨烯膜等二维薄膜，采用辉光放电的方法，利用离子束轰击其表面，使其由疏水面变为亲水面，使样品颗粒吸附在二维膜/溶液界面上从而远离气液界面。但该方法中二维膜材料对于蛋白样品的亲附性并不好，而且往往会导致更为严重的取向优势问题。

如在《PNAS》116.24，11718-11724，2019中提到的方法中，通过在辉光放电的过程中引入不同的化学基团，使石墨烯表面的疏水性质发生改变，但这种方法对于蛋白样品取向分布的改变不明显。在《JACS》141.9，4016-4025，2019中报道的方法中，通过在石墨烯膜上共价耦合镍原子，来吸附带有his标签的蛋白颗粒，但这种方法只对部分蛋白有效，衬度较差，很难实用。另外，在《PNAS》117.2，1009-1014，2020中提到的方法中，通过紫外光对单层石墨烯膜进行照射，使石墨烯表面带上含氧基团改变石墨烯的疏水性质，但氧化石墨烯膜本身也是及其疏水的。同时，也有一定数量的蛋白质不吸附在二维膜上，导致二维膜的使用受限。

因此，目前迫切需要一种制备冷冻电镜样品的方法，以解决当前冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、界面不吸附样品颗粒以及界面引起的取向优势等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备快速高效且制备质量高的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，以解决传统冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、界面不吸附样品颗粒以及界面引起的取向优势等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，包括如下步骤：

设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；

取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；

将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；