[发明专利]最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体及应用

说明书

本发明涉及一种最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体，通过分子模型和计算机分析预测几丁二糖脱乙酰酶表面电荷及酶活相关位点，再通过定点突变技术构建相关位点的突变体，筛选出不同位点突变时最适pH、酶活以及产物GlcN稳定性均较优的单突变体，构建其组合突变体，得到最适pH下降至6.0，酶活明显提高的组合突变体。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体及应用。

背景技术

目前，以N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为原料，反应条件温和，生物催化法生产氨基葡萄糖(GlcN)的研究受到广泛的重视。几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，具有良好的热稳定性。几丁二糖脱乙酰酶(Dac)对乙酰氨基葡萄糖单体有很高的催化活性，能够以GlcNAc为底物进行单酶催化反应，脱乙酰生成GlcN，实现GlcN的一步生产。

目前，通过分子模型构建及分子对接预测，一系列理性、非理性改造已经用于改造Dac，并在一定程度上提高了Dac的催化活性。然而，GlcN在酸性条件下(pH低于4.8)是稳定的，而Dac的最适pH值在7.0到8.0之间，最适温度为75℃。因此，在现有的Dac高效催化合成GlcN的同时，GlcN会自行降解，且降解速率随温度的提升逐渐加快，导致转化率降低。因此，通过降低Dac的最适pH值来保证GlcN的稳定积累也是一种提高Dac催化效率的可行策略。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶的表面电荷进行改造，降低酶催化的最适pH，解决几丁二糖脱乙酰酶最适pH过高导致产物GlcN在生产中稳定性差的问题。

本发明的第一个目的是提供一种最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体，最适pH为6.0，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的几丁二糖脱乙酰酶突变得到；其中，突变位点为

第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E、第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A、第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A、第29位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E、第106位的赖氨酸K突变为谷氨酸E和第176位的天冬酰胺N突变为谷氨酸E；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E、第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A、第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A、第29位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E、第106位的赖氨酸K突变为谷氨酸E、第176位的天冬酰胺N突变为谷氨酸E和第221位的精氨酸R突变为谷氨酸E；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E、第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A、第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A、第29位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E、第106位的赖氨酸K突变为谷氨酸E、第176位的天冬酰胺N突变为谷氨酸E、第221位的精氨酸R突变为谷氨酸E和第271位的亮氨酸L突变为谷氨酸E。

上述最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体的构建方法，包括以下步骤：

(1)几丁二糖脱乙酰酶经过丙氨酸扫描得到催化关键位点；

(2)根据步骤(1)得到的催化关键位点，构建几丁二糖脱乙酰酶的催化关键位点的所有氨基酸突变体库，筛选出酶活较高的单突变体；

(3)根据步骤(2)筛选出的酶活较高的单突变体的突变位点构建组合突变体，筛选出酶活较高的组合突变体；

(4)在步骤(3)得到的组合突变体的基础上，通过分子模拟预测与几丁二糖脱乙酰酶的表面电荷相关位点，构建几丁二糖脱乙酰酶的表面电荷相关位点的谷氨酸和天冬氨酸突变体库，筛选出对最适pH影响较大的单突变体；

(5)根据步骤(4)筛选出的对最适pH影响较大的单突变体的突变位点构建组合突变体，筛选出最适pH降低的组合突变体。