[发明专利]一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建

说明书

本发明公开了一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。本发明首先实现了不同动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达，构建得到表达猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白以及猪血红蛋白β单亚基的重组菌，在摇瓶条件下产量分别达到42.0mg/L、20.0mg/L、5.0mg/L、100.0mg/L与1.0mg/L；并进一步优化猪肌红蛋白在毕赤酵母中的分泌表达体系，最终构建得到的重组菌株X33‑△ku70‑△yps1‑1‑MB菌株48h摇瓶发酵产量达到69.0mg/L，较对照提高了59.4％。本发明有利于不同来源肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等在食品加工领域的应用及进一步发展。

技术领域

本发明涉及一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建技术，属于基因工程技术领域。

背景技术

血红蛋白是自然界中普遍存在的血红素结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟真肉的颜色和风味，需要在产品中添加血红蛋白。除此之外，肌红蛋白也被证实和真肉的肉色形成存在密切的关系。因此，随着在人造肉领域中越来越广泛的应用，国内外市场对肌红蛋白/血红蛋白的需求量也在不断增加。

肌红蛋白/血红蛋白的获取主要有两种途径。第一，从畜禽血中提取，但是这种方法由于需要使用多种有害化学试剂且提取工艺复杂，并不适合大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成血红蛋白。由于生物合成法具有低成本、条件温和、环境友好等优点，因此成为肌红蛋白/血红蛋白合成的首选方法。

毕赤酵母以其具有显著优势的蛋白表达系统(高效分泌、低蛋白糖基化以及高密度培养等)，被广泛应用于食品与制药领域。与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。毕赤酵母表达合成系统是较早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用毕赤酵母表达系统来合成动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白是最佳的选择。

目前，利用毕赤酵母虽然可以实现大豆血红蛋白的合成，但由于采用的是胞内表达形式产率较低且不易于纯化(纯度65％)，应用于人造肉食品的添加存在一定的安全隐患；而其它不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白或猪血红蛋白)在毕赤酵母中的合成还未见报道。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明首先在毕赤酵母中尝试分泌表达不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白或猪血红蛋白)；然后对猪肌红蛋白分泌表达体系进行优化(表达载体、发酵时间、毕赤酵母表达宿主、基因拷贝数以及重组蛋白促溶标签)，敲除毕赤酵母发酵过程中主要降解重组蛋白的蛋白酶基因(pep4、yps1-1与prb1)，从而进一步提高猪肌红蛋白的分泌表达量，由于蛋白分泌至胞外，简化了蛋白分离、纯化的过程。

本发明的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌是利用毕赤酵母异源表达单拷贝、双拷贝或三拷贝的肌红蛋白或血红蛋白，所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于毕赤酵母突变株和葡萄汁酵母(S.uvarum)。

在一种实施方式中，以毕赤酵母X33、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母GS115为宿主；所述肌红蛋白或血红蛋白以pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K为表达载体。