[发明专利]一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法在审
| 申请号： | 202110609593.1 | 申请日： | 2021-06-01 |
| 公开（公告）号： | CN113355457A | 公开（公告）日： | 2021-09-07 |
| 发明（设计）人： | 周显凤 | 申请（专利权）人： | 南昌市疾病预防控制中心 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京盛凡智荣知识产权代理有限公司 11616 | 代理人： | 王小燕 |
| 地址： | 330038 江西*** | 国省代码： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 merkel 细胞 病毒 荧光 定量 pcr 检测 方法 | ||
1.一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法以Merkel细胞多瘤病毒的大T抗原基因LTag为检测对象。
2.根据权利要求1所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法采用的PCR引物为：
正向引物5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’；
反向引物5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’。
3.根据权利要求1所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法以待测样品为模板，以序列为5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增。
4.根据权利要求3所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，在所述执行荧光定量PCR扩增之前，先以标准品为模板，以序列为5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。
5.根据权利要求4所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述标准品是由以下方法制备的：人工合成两端分别含有BamHI和XbaI限制性内切酶位点的MCV LTag全基因序列，克隆至pTA22质粒，得到pTA22-MCV质粒，对质粒DNA进行核酸定量和纯度检测，再进行稀释，得到若干已知浓度的标准品。
6.根据权利要求3～5任一项所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：DNA模板2μL，正向引物和反向引物混合物2.5μL、2×Thunderbird SYBR qPCR Mix 10μL、ddH2O 3μL。
7.根据权利要求3～5任一项所述的一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃1min变性；95℃15s，60℃1min进行荧光信号收集，45个循环。
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