[发明专利]一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明提供了一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法。该技术方案首先确定了Merkel细胞多瘤病毒的一种特异性标志物，即大T抗原基因LTag；在此基础上，以其为检测对象进行荧光定量PCR扩增。基于LTag良好的特异性以及qPCR的高效性，实现了对Merkel细胞多瘤病毒的快速、灵敏检测。此外，本发明利用LTag全基因序列和pTA22质粒构建重组质粒，经核酸定量和纯度检测后可作为标准品用于绘制标准曲线，从而作为本发明检测方法的定量依据。实验验证表明，本发明具有良好的特异性和灵敏性，而且操作简便、检测快速，可用于临床病例的快速筛查诊断。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及荧光定量PCR技术，具体涉及一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法。

背景技术

Merkel细胞癌(Merkel cell carcinoma，MCC)是一种罕见的皮肤神经内分泌肿瘤，有较高的复发率和转移率。有统计表明，北半球地区近80％的MCC病例是由Merkel细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCV)引起的，因此对Merkel细胞多瘤病毒的检测在临床上具有重要意义。然而，目前缺乏快捷灵敏的检测试剂，使得疾病难以确诊且容易延误治疗。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，以解决目前，尚未确定Merkel细胞多瘤病毒的特异性标志物的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是，如何提供一种Merkel细胞多瘤病毒的灵敏、快速的检测方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种Merkel细胞多瘤病毒荧光定量PCR检测方法，该方法以Merkel细胞多瘤病毒的大T抗原基因LTag为检测对象。

作为优选，该方法采用的PCR引物为：

正向引物5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’；

反向引物5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’。

作为优选，该方法以待测样品为模板，以序列为5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增。

作为优选，在所述执行荧光定量PCR扩增之前，先以标准品为模板，以序列为5’-TTGTCTCGCCAGCATTGTAG-3’和5’-ATATAGGGGCCTCGTCAACC-3’的DNA片段为正向引物和反向引物，执行荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。

作为优选，所述标准品是由以下方法制备的：人工合成两端分别含有BamHI和XbaI限制性内切酶位点的MCV LTag全基因序列，克隆至pTA22质粒，得到pTA22-MCV质粒，对质粒DNA进行核酸定量和纯度检测，再进行稀释，得到若干已知浓度的标准品。

作为优选，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：DNA模板2μL，正向引物和反向引物混合物2.5μL、2×Thunderbird SYBR qPCR Mix 10μL、ddH₂O 3μL。

作为优选，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃1min变性；95℃15s，60℃1min进行荧光信号收集，45个循环。