[发明专利]一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法

说明书

本发明提供了种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法，本发明通过针对新型冠状病毒2019‑nCoV‑B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株上的S基因上的五个突变位点设计对应的引物探针组合以及阻遏序列的设计；从而能够特异性的扩增含上述突变位点的目标序列，而对不含上述突变位点的序列，其扩增效率较低或无扩增，根据扩增结果Ct值的差值，从而特异性地检测被测样本中的B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株序列。因此，以本方案中的正向引物、反向引物、探针和阻遏序列扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示B.1.1.7突变株、B.1.351突变株和P.1突变株的有无，减少核酸检测时假阴性和假阳性的情况发生，进而减少漏检和误判情况。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤指一种用于新型冠状病毒突变株检测的引物探针组合、试剂盒及分型检测方法。

背景技术

新型冠状病毒2019-nCOV属于Beta冠状病毒属(Beta coronavirμs)，Beta冠状病毒属是蛋白包裹的单链正链RNA病毒，寄生和感染高等动物(包括人)，其来源于一种HKμ9-1类似的病毒，在进化分支上，与SARS(导致2002年“非典”)病毒和类SARS(SARS-like)病毒的类群相邻，但并不属于SARS和类SARS病毒类群。该病毒基因组长约30kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区，非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame,ORF)1a和ORF1b基因,编码16个非结构蛋白(non-strμctμralproteins,NSP),即NSP1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(nμcleocapsid,N)蛋白。其中，N基因、ORF1a基因、ORF1b基因、E基因等因其保守型较高，常作为新型冠状病毒核酸检测的靶点；而S基因变异为病毒进化的主要变异来源，常作为特定突变株核酸检测的靶点。

新型冠状病毒肺炎疑似病例的应从流行病学史和临床表现2方面进行确定，其中，临床表现如下：发热和(或)呼吸道症状等新冠肺炎相关临床表现；具有上述新冠肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数正常或减少。有流行病学史且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且新型冠状病毒特异性IgM抗体阳性且符合临床表现任意2条；或无流行病学史且符合临床表现全部3条者，可诊断为疑似病例。新型冠状病毒肺炎疑似病例如满足如下病原学或血清学证据之一，即：实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高，即可诊断为新型冠状病毒肺炎确诊病例。核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊标准之一，也是目前性新冠状病毒检测最常用、最有效的检测方法。

自疫情爆发以来，新型冠状病毒便持续变异，世界卫生组织(WHO)曾通报了自新冠病毒疫情暴发以来主要4种病毒变异情况，分别为D614G突变株、“Clμster 5”突变株、B.1.1.7突变株和B.1.351突变株。

B.1.1.7共有23个突变位点，其中，最重要的突变位点是位于S基因上的N501Y突变位点、69-70del突变位点和P681H突变位点。N501是S蛋白受体结合结构域(Receptor-Binding Domain，RBD)上的6个关键氨基酸之一，有研究表明，该位点突变可使得RBD与受体ACE2的亲和力增加，且已在小鼠模型中证明；69-70del突变位点有助于提高病毒的免疫逃逸能力，表现为降低部分血清的中和敏感性；P681H突变位点则有助于S蛋白的切割，从而提高其与受体ACE2的亲和力。