[发明专利]葛根素6′′-O-乙酸酯的酶促合成方法

说明书

本发明提供了两种葛根素6″‑O‑乙酸酯的酶促合成方法，具体涉及以麦芽糖‑O‑酰基转移酶(MAT)为生物催化剂，催化葛根素与双醋瑞因或乙酰辅酶A合成葛根素6″‑O‑乙酸酯，属于生物催化领域。经过条件优化以及MAT的定向进化，以双醋瑞因为酰基供体，突变体MAT‑E125V，MAT‑E125M，MAT‑E125R对葛根素的转化效率从68.10％最高可提升至94.03％。以乙酰辅酶A为酰基供体，突变体MAT‑E125N，MAT‑E125T，MAT‑E125P对葛根素的转化效率从29.62％最高可提升至68.53％。

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6″-O-乙酸酯的方法和一种以乙酰辅酶A为酰基供体酶促合成葛根素6″-O-乙酸酯的方法。

背景技术

葛根素(puerarin)是一种分离自中药葛根的异黄酮类化合物。目前，葛根素注射液已被开发上市，临床上常用于治疗冠心病、心绞痛和突发性耳聋等疾病。此外，葛根素还具有保护神经系统、修复肝损伤等功能，因此也被用于糖尿病及其并发症、阿尔茨海默症、酒精性肝损伤等疾病的联合用药。随着临床应用范围的扩大，葛根素所导致的不良反应逐渐被报道，包括药物致热、变态反应和溶血等。这些不良反应的产生大多与葛根素溶解性差、生物利用度低有关。

葛根素结构特殊，其4′位和7位酚羟基易形成分子氢键，增强葛根素分子间的作用力，降低了其在油脂体系和水溶性体系中的溶解性，使其难以达到有效浓度，从而降低了临床疗效。为了改善葛根素的溶解性和生物利用度，常对葛根素进行结构修饰以获得相关性质改善的葛根素衍生物。

酰基化修饰可协助提高葛根素脂溶性，强化其生物活性与药效。由于葛根素具有多羟基结构，因此基于酶法合成的生物催化因其高选择性成为葛根素单位点酰基化修饰的有力工具。基于以上研究现状，急需开发葛根素单酰化衍生物的酶促合成方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6″-O-乙酸酯的方法。

本发明提供的一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6″-O-乙酸酯的方法，以麦芽糖-O-酰基转移酶(Maltose-O-acetyltransferase，MAT，accession No:ACT42309.1)为催化剂，催化葛根素和双醋瑞因生成葛根素6″-O-乙酸酯，具体反应式如下：

具体的，上述反应过程中，1分子的酰基供体双醋瑞因可提供2分子的乙酰基。

所述麦芽糖-O-酰基转移酶MAT来源于大肠杆菌BL21(DE3)，其氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

上述酶催化体系中，葛根素与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:1；反应温度为20～80℃；反应pH为3～9。

作为优选，反应温度为20～60℃；反应pH为4～8。更优选，反应温度为30～60℃；反应pH为4.5～7。最优选，反应温度为30～50℃；反应pH为4.5～6。

在最优选条件下，本发明还提供了以麦芽糖-O-酰基转移酶MAT为生物催化剂，以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6″-O-乙酸酯的转化效率为68.10％。

进一步，为提高上述方法的合成效率，本发明还提供了通过定向进化获得的活性显著提高的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125V，MAT-E125M，MAT-E125R。以双醋瑞因为酰基供体，其合成葛根素6″-O-乙酸酯的效率分别提升至94.03％，92.81％，92.18％。

具体的，麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125V，MAT-E125M，MAT-E125R得氨基酸序列选自SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，核苷酸序列选自SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.8。