[发明专利]检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法

说明书

本发明公开了检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法，属于病原检测技术领域。本发明针对VPAHPND毒力因子PirA和PirB设计引物，并利用该引物进行多重PCR扩增，并且引物具有特异性强和灵敏度高的特点；通过该引物构建的多重PCR方法操作简单且便于实施，该方法能够实现对于对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的准确鉴别，利于对不同对虾养殖场鉴别AHPND做出技术指导，以便于及时针对性的对AHPND进行防控和治疗。

技术领域

本发明涉及病原检测技术领域，涉及一种检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法。

背景技术

对虾急性肝胰腺坏死综合症是近年来影响对虾养殖最为严重的疾病之一。早期该病主要发生于对虾苗期，统称为早期死亡综合症(Early mortality syndrome，EMS)。该病的肝胰腺坏死症状与对虾其它早期死亡症状存在明显不同，因此，联合国粮农组织和亚太地区水产养殖联盟(NACA)将之命名为肝胰腺坏死综合症(Hepatopancreas necrosissyndrome，HPNS)或急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreasnecrosis disease，AHPND)。

迄今为止，AHPND只发生于凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾。已有的研究显示，在凡纳滨对虾虾苗、幼虾阶段等都能检测到病原的存在。但近几年来，AHPND的发生季节不明显，放苗60天后常有发生。高温季节、放养密度高等对虾发病率较高，养殖集中区域发病率较高，单养池塘的对虾患病几率和受影响程度均高于虾鱼混养池塘。

2013年5月1日全球水产养殖联盟(GAA)宣布，亚利桑那大学研究团队经过数月的调查研究发现了导致AHPND的病原体。美国莱特纳教授领导的研究小组发表声明：由未知因子引起的在中国和东南亚暴发的AHPND其病原已经被确定：一种副溶血弧菌(VPAHPND)。Sirikharin等纯化VPAHPND的菌液上清用来感染健康对虾，48h内引起健康对虾极高的死亡率，SDS琼脂糖凝胶电泳发现两段分子量分别为12kDa和50kDa的蛋白PirA、PirB。Lee将接合缺少PirvpAB操纵子的pVA1-like质粒的VP菌株进行回归感染实验，结果未出现感染现象，进一步证明了PirA和PirB是AHPND发生的主要毒力因子的观点。

PCR技术是分子生物学的基础，自其问世以来，便应用于现代生物学的各个方面，且在常规PCR的基础上，发展了其它PCR技术，如逆转录PCR(touch down)、降落PCR等等。多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一反应体系中加入两对及两对以上的引物，可以同时检测多个目的基因，产生多个目的条带。多重PCR已成为鉴定病毒，细菌和寄生虫的有效工具，目前虽然已经有针对AHPND进行多重PCR的方法报道，但是都是针对AHPND是否发生进行鉴定，而并没有对引起AHPND的病原进行分型的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法，针对VPAHPND毒力因子PirA和PirB设计引物组合，采用多重PCR方法扩增PirA和PirB，实现对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的准确鉴定，为不同地区对虾养殖AHPND的控制提供技术指导。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的引物，包括用于检测VPAHPND毒力因子PirA和PirB的引物对，所述引物对为：

PirA-F：5’-CGTGGGGAGCTTACCATTCA-3’；

PirA-R：5’-AAACCACGACTAGCGCCATT-3’；

PirB-F：5’-AAACTTCGGTTATGCTGCGG-3；

PirB-R：5’-CACCAACTACGAGCACC CAT-3’。