[发明专利]一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明从林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)蛋白酶K分子结构入手，得热稳定性提高的突变体，将编码蛋白酶K野生型及其突变体基因与pPICZαA质粒连接构建重组表达载体，并将该重组表达载体转化至巴斯德毕赤酵母中构建重组工程菌进行异源分泌表达，采用高效的阳离子交换层析纯化蛋白即得野生型蛋白酶K(PRK‑WT)和突变型蛋白酶K(PRK‑T94Y、PRK‑7Y)，突变型蛋白酶在25℃、pH 6.0条件下保存12个月能够保留95％以上的活力。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的蛋白酶K突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，底物谱非常广泛且具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶K不仅可用于生化实验，例如，在核酸提取中用于除去核酸中的DNA酶和RNA酶，在原位杂交中用于降解包围靶DNA的蛋白质、处理杂交前的样本，以提高检测的敏感性；还可以用于IVD生化检测试剂和分子诊断试剂。

早期商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶K的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。后来罗氏诊断等公司利用毕赤酵母表达体系实现了蛋白酶K的分泌表达，提高了蛋白酶K的产量，降低了其纯化成本，同时提升了蛋白酶K的品质。

一般条件下，蛋白酶K使用的pH范围是7.5-9.0之间，在20-60℃之间蛋白酶K的活性都可以达到80％以上。蛋白酶K与其他蛋白酶的区别还在于该酶在含有Triton X-100、尿素、SDS、盐酸胍的环境中仍能稳定存在且具有活性，这一特性使它的应用很广泛。但野生型蛋白酶K在常温条件保存一年后，保留30-40％的活力。2020年新冠病毒爆发后，世界对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，野生型蛋白酶K在常温保存时的稳定性差导致其跨国低温长途运输成本很高。为了实现能够在常温长时间运输后酶活力保持不变，急需筛选出热稳定性大幅度提高的蛋白酶K。

现有改造蛋白酶K的方法主要是通过计算机的算法，将蛋白酶K氨基酸序列的一个或多个氨基酸进行取代后进行表征，再反馈给计算机算法，再形成变量集进行表征，再反馈给是计算机算法，如专利US8005620B2通过此方法筛选出了潜在24个氨基酸位点(N95C、P97S、S107D、S123A、E138A、M145F、Y151A、V167I、L180I、Y194S、A199S、K208H、A236V、R237N、P265S、V267I、S273T、G293A、L299C、I310K、K332R、S337N、P355S)。但经过国内外学者多年的验证，其中只有少数突变位点提高蛋白酶K的比活性，对进一步提高蛋白酶K热稳定性并无作用。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有的蛋白酶K在常温下保存一年之后，酶活仅能仅能保留30-40％。

[技术方案]

本发明提供一种蛋白酶K突变体，包括：信号肽、前导肽、成熟肽部分，是(a)或(b)或(c)：

(a)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，对第109位氨基酸进行了突变，

(b)在(a)的基础上，对前导肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)在(a)或(b)的基础上，成熟肽部分有97％序列同一性的、具有蛋白酶K活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。