[发明专利]一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶的截断酶作为亲本，构建了四点突变体酶A310E/S346A/I478M/A491S(简称M4)，并进一步截断N‑端33个氨基酸的突变体M4^N‑33。M4^N‑33在55℃的半衰期由原来的不足5min提高到大约10h，熔融温度由原来的55.00℃提高到61.27℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃，在最适催化条件下的酶活提高了52％。这一发现对于工业化制备微生物菊糖及转糖苷酶的工业化应用有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

菊糖蔗糖酶(Inulosucrase，EC 2.4.1.10)是一种蔗糖利用酶。当以蔗糖为唯一底物时，该酶可以催化蔗糖的水解反应和转果糖基反应，生成高分子量微生物菊糖。低分子量的植物菊糖食品、医药等领域有着广泛应用。而高分子量微生物菊糖在溶解性、成胶性和贮藏稳定性方面表现出比植物菊糖更优的性质。此外，作为一种转果糖基酶，菊糖蔗糖酶还可以以蔗糖为供体，一些其他糖类为受体，生产新型低聚糖。

Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶的酶活性在同类酶中处于较高水平，而热稳定性不是很突出，55℃保温5min，剩余酶活不足原始酶活的一半，这使该酶的实际工业应用受到了很大的限制。目前，虽然已有2种Inulosucrase的晶体结构得到解析，催化机理和糖链延伸机制也得到了初步解析，然而关于其热稳定性改造的研究依然很少。因此，开发具有良好热稳定性的Inulosucrase对于微生物菊糖的生产具有重要的意义。

发明内容

技术问题：

目前，已经报道的菊糖蔗糖酶为17个，且大多数的热稳定性较差，或者酶活力较低。因此可以对菊糖蔗糖酶进行提高热稳定性和酶活力分子改造。

本发明提供一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，这一发现对于工业化制备微生物菊糖及转糖苷酶的工业化应用有重要的现实意义。

技术方案：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶(Laga-ISΔ138-702)进行分子改造。

本发明的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述菊糖蔗糖酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第310位的丙氨酸替换为谷氨酸，将346位丝氨酸替换为丙氨酸，将478位的异亮氨酸替换为蛋氨酸，将491位的丙氨酸替换为丝氨酸，并截断N-端的33个氨基酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述菊糖蔗糖酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pET系列载体。

在一种实施方式中，所述载体包括pET-22b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达菊糖蔗糖酶突变体的细胞。

在一种实施方式中，所述细胞包括细菌、真菌或古细菌。

本发明的第五个目的是提供表达所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌。