[发明专利]禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法

权利要求书

1.一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)设定禽流感血凝抑制试验固定的参照血凝效价为11log₂，设定新城疫血凝抑制试验固定的参照血凝效价为12log₂；

(2)按照《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》配制禽流感参照血凝效价11log₂或新城疫参照血凝效价12log₂的4HAU抗原；

(3)取2个96孔V型微量反应板横向相邻放置，第2个96孔V型微量反应板作为第1个板的加长，用移液器在第1孔-第15孔各加入0.025mL PBS，第16孔加入0.05mL PBS；

(4)在第1孔加入0.025mL禽流感或新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出0.025mL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第14孔，第14孔弃去0.025mL，第15孔为阳性对照，第16孔为PBS对照；

(5)在第1孔—15孔各加入0.025mL 4HAU抗原，叩动反应板，使反应物混合均匀，20℃-25℃室温下静置不少于30min，或在4℃环境下静置不少于60min；

(6)每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液或0.75％鸡醛化红细胞悬液，晃动混匀反应板后，20℃-25℃室温下静置35-45min，或在35-40℃恒温静置12-18min，当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果；

(7)结果判定，在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，1-3s内看红细胞是否呈泪珠状流下，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log₂，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果判定有效，记录试验抗体效价数值；

(8)禽流感抗体效价公式：参照血凝效价11log₂比正确血凝效价数值多Y个滴度，禽流感抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log₂，Y＝0、1、2、3、4；

(9)新城疫抗体效价公式：参照血凝效价12log₂比正确血凝效价数值多Y个滴度，新城疫抗体效价＝(试验抗体效价数值-Y)log₂，Y＝0、1、2、3、4。

2.根据权利要求1所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(8)或步骤(9)中，若计算出的禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于10，则禽流感抗体效价或新城疫抗体效价记为10log₂；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价小于或等于3log₂，则判定抗体试验为阴性；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价等于4log₂，则判定抗体试验为可疑，需重复试验；若禽流感抗体效价或新城疫抗体效价大于或等于5log₂，则判定抗体试验为阳性。

3.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，红细胞悬液在使用前，在移液槽内加满红细胞悬液，每次吸取槽底的红细胞悬液加入。

4.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PBS为pH7.2磷酸盐缓冲液，其配置方法包括如下步骤：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钠0.24g，加蒸馏水至1000mL，将上述成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，121℃，15min灭菌。

5.根据权利要求1或2所述的一种禽流感和新城疫的血凝抑制试验检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中1％鸡红细胞悬液的制备方法包括如下步骤：用阿氏液作为抗凝剂，采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3-4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3-4次，洗净血浆和白细胞，2000r/min离心10min，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1％的悬液，于4℃保存备用。