[发明专利]一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法

说明书

本发明涉及植物显微技术领域，具体是一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法。本申请制作得到睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片，可以在光学显微镜下观察，花粉管呈深蓝色(近似黑色)，能清晰看到花粉管在睡莲雌蕊中的生长情况，包括授粉后花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠数量。该压片无需在荧光显微镜下观察雌蕊中的花粉管与胚珠，仅仅依靠光学显微镜即可，极大的降低了观测成本。

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，具体是一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法。

背景技术

睡莲(学名：Nymphaea)是我国新兴的水生植物，其花色丰富、香味浓郁，具有水体净化的功能，在中国的广西、海南等地区，群体花期可达9个月以上，在城市的水生园林景观、观光农业中的应用日渐广泛，人们对睡莲优良新品种的需求也日益增加。杂交育种是创制睡莲新品种的主要手段，然而在杂交过程中，亲本之间常常因杂交亲和性低的原因而无法结实，导致优势基因难以利用。因此，杂交亲和性的研究对于睡莲的杂交育种至关重要。

观察睡莲花粉管与胚珠的生长情况是研究睡莲杂交亲和性的重要手段之一，对于睡莲杂交育种有重要的指导意义。石蜡制片是常用的微观组织制备技术，将组织切成1至10微米的薄片，多运用于雌蕊细小的植物，而睡莲的雌蕊结构特殊，体型较大，花粉管可横纵生长，通过石蜡制片难以获得完整的花粉管组织。目前常用石蜡切片观察睡莲的胚珠，用扫描电镜观察花粉管(《睡莲品种墨宝自交结实率低的细胞学机理》，孙春青，潘跃平，单延博，孙国胜，戴忠良，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏农业学报，2017，33)；或者用荧光显微镜观察睡莲花粉管，再用石蜡切片的方法观察睡莲的胚珠。传统的授粉雌蕊荧光显微观察技术是利用苯胺蓝与花粉管壁中的胼胝质结合，在紫外光下花粉管呈现明亮黄绿色荧光，已经广泛应用于植物杂交亲和性检测当中，然而荧光显微镜与普通的光学显微镜相比造价昂贵，使用成本高，不适用于许多小型实验室。

因此，寻找一种在光学显微镜的条件下，也能够快速、完整的观察到睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法是目前的当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法。

一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片制作方法，由对授粉后的睡莲花雌蕊的采样、子房室分离、固定样本、软化组织、组织染色、组织压片、干燥七个步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样：摘下已经授粉的睡莲花花朵，剥离花瓣、花托，仅留下雌蕊；

(2)子房室分离：睡莲的雌蕊中整齐排列10到20个子房室，将子房室一一分离，可以最大限度的减少子房室内膜的损伤，防止内部的胚珠泄露，有效的分离子房室；

(3)固定样本：迅速将样本轻轻放入组织固定液中，杀死细胞，固定24小时以上；

(4)软化组织：在23-27℃条件下，将组织浸泡在4-6mol/L NaOH溶液中静置6-8小时；

(5)组织染色：将完成软化的待检样本置于盛有蒸馏水的培养皿清洗，随后，将样本置于乳酸酚棉蓝染色液中染色，静置8至12分钟；

(6)组织压片：采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理；

(7)干燥：此时，样本制片已基本完成，但两载玻片之间含有大量的水分、多余的染色液和气泡，影响光学显微观察效果，且不利于样本制片的长期保存，将样本制片置于恒温电烘箱中，33-37℃干燥3至5小时，去除样本中的水分。

进一步的，所述的雌蕊，包括雌蕊中的花粉管。

进一步的，所述步骤(2)，将子房室一一分离的方法，具体是：每个子房室外侧上方有一个雌蕊附属物，沿着雌蕊附属物的边缘进行切片，将子房室一一分离。