[发明专利]编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用

权利要求书

1.利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA，其特征在于核苷酸序列分别为sgRNA1：SEQ ID NO.1、sgRNA2：SEQ ID NO.2。

2.用于不结球白菜CENH3基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于所述的载体为插入权利要求1所述的sgRNA核苷酸序列的pYLCRISPR/Cas9-DB载体。

3.权利要求1所述的sgRNA在构建不结球白菜CENH3基因获得的单倍体诱导系中的应用。

4.权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体在构建不结球白菜单倍体诱导系中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的单倍体诱导系为不结球白菜CENH3基因突变株。

6.一种利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法，其特征在于，基于不结球白菜CENH3基因设计权利要求1所述的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，利用植物花粉纳米磁转化技术转化不结球白菜，得到不结球白菜CENH3基因的定点突变植株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于不结球白菜CENH3基因设计如权利要求1所示的sgRNA，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，构建以除草剂基因为植株筛选抗性基因的转化载体Brcenh3-Cas9；

(2)利用植物花粉纳米磁转化技术转化不结球白菜，将质粒DNA连接纳米磁珠得到基因-磁性纳米载体复合物，在花粉培养基中于不结球白菜花粉混合后进行磁转处理，得到磁转化花粉；

(3)将磁转化花粉晾干后，进行蕾期人工授粉，套袋留种；

(4)收取转化种子后，播种后对植株进行除草剂抗性鉴定；

(5)提取植株的 DNA 进行 PCR 检测，确定Cas9阳性转基因植株，并根据sgRNA编辑位点的核苷酸序列设计引物对突变区域进行克隆，测序鉴定不结球白菜植株CENH3突变位点。

8.根据权利要求6所述的 方法，其特征在于，所述的携带CRISPR/Cas9的载体为pYLCRISPR/Cas9P_35S-B载体。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)的引物序列如下：CENH3-F: SEQID NO.11、CENH3-R：SEQ ID NO.12。