[发明专利]编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用

说明书

本发明公开编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用，本发明设计了不结球白菜CENH3基因的sg RNA，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，将连接了目的DNA片段的CRISPR/Cas9载体转入不结球白菜基因组中，通过基因编辑实现对不结球白菜CENH3基因的定点突变。本发明使用花粉纳米磁转化技术结合CRISPR/Cas9技术对不结球白菜内源基因CENH3进行编辑，通过植株抗性筛选、PCR检测、基因测序筛选得到CENH3单倍体诱导系，为在不结球白菜双单倍体育种中利用CENH3介导的染色体消除机制获得单倍体奠定基础。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体涉及编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用。

背景技术

不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)属异花授粉作物，其杂种优势显著，利用植物杂种优势的关键内容是选择基因型纯合、性状一致、遗传基础简单的纯合自交系，但在十字花科作物中，采用传统的育种方法获得纯合系需要连续自交7-8个世代。若获得单倍体植株，经过染色体加倍则可在一个世代就可以获得DH(doubled haploid)纯系，加快育种进程。目前不结球白菜的单倍体育种主要依赖植物组织培养技术诱导产生单倍体植株，再通过染色体组加倍得到双单倍体，但组织培养对于不结球白菜各个品种而言单倍体诱导效率低且周期长。

着丝粒特异组蛋白CENH3，真核生物的功能着丝粒中核小体组蛋白H3的变体，对着丝粒在染色体上的定位起重要作用。2010年，在拟南芥着丝粒组蛋白CENH3的研究中首次发现拟南芥cenh3无效突变体具有致死性，将经过遗传修饰的着丝粒特异性组蛋白编码基因CENH3导入该拟南芥突变体，可恢复植株的野生表型，转基因植株与野生型植株杂交可产生只含野生型基因组的单倍体。先正达公司将单倍体诱导与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，在两个世代内即可创造经基因编辑改良的双单倍体。由于CENH3组蛋白折叠结构域(HFD)非常保守，点突变造成的HFD单个氨基酸改变会降低CENH3的着丝粒结合功能，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对不结球白菜CENH3基因定点突变，是得到单倍体诱导系的一种快速可行的方法。

在棉花上，使用Fe₃O₄磁性纳米颗粒作为新材料，以静电吸附作用与带负电的外源质粒相结合，形成磁性纳米颗粒/DNA复合物，在磁场下使复合物通过花粉表面的孔穴进入花粉，再通过人工授粉实现外源基因的导入与转化，利用整体植株的生殖细胞进行转化，可直接收获转基因种子，并可针对性地对转基因植株的目标性状定向筛选，能够与转基因育种直接结合，从而提高目的基因的转导效率，缩短育种周期，这对于发展不结球白菜单倍体育种技术结合基因编辑技术、加速新种质材料的大规模制备和优良新品种的培育进程具有重要的参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其构建的CRISPR/Cas9载体。

本发明的另一目的是提供上述sgRNA及其构建的CRISPR/Cas9载体的应用。

本发明的又一目的是提供一种利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法。

为了实现本发明目的，本发明选择不结球白菜CENH3基因为靶基因，提供利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法，根据不结球白菜CENH3基因设计sgRNA，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，使用植物花粉纳米磁转化技术转化基因编辑载体的方法，将连接了目的DNA片段的CRISPR/Cas9载体通过磁性纳米颗粒/DNA复合物转入不结球白菜基因组中，通过基因编辑实现对不结球白菜CENH3基因的定点突变。