[发明专利]一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法

说明书

本发明公开了一种添加微生物诱导子的ε‑聚赖氨酸生物合成方法，筛选了对ε‑PL合成影响最大的几种微生物源诱导子，并优化了此类诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式，并以此为基础进行了ε‑PL的分批发酵和补料分批发酵。与传统ε‑PL液态发酵相比，本发明所示的添加微生物诱导子的ε‑PL发酵方法能够显著提高ε‑PL产量、生产强度，在ε‑PL工业化生产中具有重要的意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及一种ε-聚赖氨酸的合成方法，具体涉及一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法，通过对一些微生物细胞进行萃取，将萃取得到的混合物添加于液态发酵中使得细胞高效合成ε-聚赖氨酸，属于工业生物技术领域。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种由L-赖氨酸单体通过α-羧基及ε-氨基形成的同型氨基酸聚合物，其主要由链霉菌属微生物产生。ε-PL具有广泛的抑菌谱和较高的安全性，被美国FDA评价为GRAS化合物，并于2014年被我国卫计委批准用于食品的防腐保鲜。此外，ε-PL作为一种安全且环境友好的生物聚合物，还在乳化剂、食疗剂、干扰素诱导物、药物递送载体、基因递送载体、生物芯片、水凝胶等领域有着应用。然而，目前ε-PL生产成本较高，这对其应用的拓展产生了较大的制约。如何通过提高发酵水平来降低其应用成本成为了学术界和产业界共同关心的问题。

目前，液态深层发酵是工业化生产ε-PL的主要途径。本领域研究人员为提升ε-PL的生物合成水平，近年来进行了大量的研究和实践，包括高产菌的选育、发酵培养基的优化、发酵过程重要参数调控、产物原位提取、细胞固定化等。上述研究旨在于为链霉菌生物合成ε-PL 提供适宜的营养和环境，然而，对于“链霉菌为何要合成这个产物”这个根本问题，目前尚没有答案，更没有基于该问题结论所提出的科学技术构想。

大量研究实践得出，链霉菌属微生物是一类合成抑菌物质(抗生素、细菌素等)的宝库。抑菌物质对于生长繁殖慢、细胞扩散程度低的放线菌而言，是其在自然环境中对抗其他微生物保证自身获得营养和生存空间的重要手段，是其和生长迅速的细菌、扩散能力强的霉菌对抗的武器。同样，作为能够广谱抑菌的ε-PL，其合成的源动力极有可能是在收到临近微生物释放出来的某种信号后，自身产生某种应激，促使其快速合成具有抑菌效应的ε-PL来抑制或杀死周围微生物，保护自身的生存。

本发明立足于“其他微生物诱导子诱发ε-PL快速合成”这一假设，研究了不同类型微生物对ε-PL生物合成的影响，并由此开发出一套采用外源添加微生物诱导子的方式促进ε-PL合成的生产方法。本方法可显著提高ε-PL分批发酵中的生产强度，提升ε-PL补料分批发酵中的最终产量，在ε-PL生物合成中具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明筛选了对ε-PL合成影响最大的几种微生物源诱导子，并优化了此类诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式，并以此为基础进行了ε-PL的分批发酵和补料分批发酵，由此提出了一种添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法。

为实现本发明的目的，本发明的微生物源诱导子来自于细菌和真菌，细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，真菌包括酵母、霉菌。

本发明的反应器包括250mL三角瓶、5L液态发酵罐两种。

以上微生物源诱导子筛选、诱导子的最佳添加量、添加时间、最佳诱导子合成时间、诱导子的保存方式、诱导子的提取方式实验均在250mL三角瓶中完成，ε-PL的分批发酵和补料分批发酵在5L发酵罐中进行。

本发明添加微生物诱导子的ε-聚赖氨酸生物合成方法，包括如下步骤：

步骤1：发酵种子培养