[发明专利]一种用于制备L-塔格糖的双酶催化体系及应用

说明书

本发明提供了一种用于制备L‑塔格糖的双酶催化体系及应用，属于生物工程技术领域；本发明中，将来源于变形链球菌的产水型NADH氧化酶和来源于球形红球菌的半乳糖醇脱氢酶偶联构建成用于制备L‑塔格糖的多酶催化体系，该多酶催化体系生产成本低、无其他副产物、纯化难度低。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于制备L-塔格糖的双酶催化体系及应用。

背景技术

L-塔格糖（D-塔格糖的对映异构体）是一种理想的甜味剂和增味剂，可作为多种重要化合物如L-脱氧-半乳糖苷嘧啶和1,2,3,4-二-异丙基-呋喃糖的合成原料，在食品行业具有广阔的应用前景。但是，L-塔格糖的合成成本高，产量低，难以进行大规模的应用。

目前，主要用化学合成法和生物合成法来制备L-塔格糖。化学合成法转化率较低，生成的副产物较多以及官能团保护及脱保护反应十分复杂，难以进一步应用于L-塔格糖的工业生产。生物合成法主要采用全细胞（表达半乳糖醇脱氢酶）或纯化后的半乳糖醇脱氢酶（GatDH）以D-半乳糖醇为底物催化合成L-塔格糖，该方法转化率高且简单快捷，但仍存在一些不足。如全细胞法无法以较高浓度的D-半乳糖醇为底物有效合成L-塔格糖，并且当重组细胞中局部的半乳糖醇脱氢酶的浓度较高，细胞内部辅酶NAD⁺的自身再生过程无法有效满足细胞催化反应过程中大量NAD⁺的需求，进而影响L-塔格糖产率。

基于球形红杆菌D（Rhodobacter sphaeroides D）的半乳糖醇脱氢酶GatDH的无细胞生物催化法虽然不存在细菌细胞壁阻碍，并且可外部提供辅因子而更适用于L-塔格糖的大量生产，但在生产过程中仍需要持续添加昂贵的辅酶NAD⁺。尽管上述体系中可通过以乳酸脱氢酶作为NAD⁺再生酶，并以乳酸作为共底物催化NADH转化为NAD⁺，但乳酸的添加以及反应中形成的大量的副产物丙酮酸可能会极大影响酶的催化效率，还会增加产物L-塔格糖的分离纯化难度从而极大增加L-塔格糖合成成本。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种用于制备L-塔格糖的双酶催化体系及应用。本发明中，将来源于变形链球菌的产水型NADH氧化酶和来源于球形红球菌的半乳糖醇脱氢酶偶联构建成用于制备L-塔格糖的多酶催化体系，该多酶催化体系生产成本低、无其他副产物、纯化难度低。

本发明中首先提供了一种用于制备L-塔格糖的双酶催化体系，所述多双催化体系包含NADH氧化酶、半乳糖醇脱氢酶和NAD⁺辅酶因子，其中，体系中NADH氧化酶、半乳糖醇脱氢酶和NAD⁺辅酶因子用量比为1-1.5 U/mL：2-2.25 U/mL：1~3 mM。

进一步的，所述NADH氧化酶为变形链球菌（Streptococcus mutans）的产水型NADH氧化酶。

进一步的，所述半乳糖醇脱氢酶为球形红球菌（Rhodobacter sphaeroides）的半乳糖醇脱氢酶。

本发明中还提供了上述用于制备L-塔格糖的双酶催化体系在生物催化合成L-塔格糖中的应用，具体包括如下步骤：

将D-半乳糖醇用Tris-HCl缓冲液溶解，然后加入半乳糖醇脱氢酶液和NADH氧化酶液，然后加入NAD⁺辅酶因子，得到反应体系，磁力搅拌反应，得到L-塔格糖。

进一步的，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为9.0。

进一步的，D-半乳糖醇用Tris-HCl缓冲液溶解后浓度为100 mM。

进一步的，所述半乳糖醇脱氢酶在反应体系中的终浓度为1~1.5 U/mL，NADH氧化酶酶液在反应体系中的终浓度为2~2.25 U/mL。