[发明专利]一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法

说明书

本发明涉及靶向克隆技术领域，特别涉及一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法。包括：带有tos的环形质粒通过PCR扩增方式，在体外扩增并使用TelN原端粒酶酶切获得线性化的克隆载体同时，在载体两端引入与目标基因组片段侧翼相同的序列，得到高浓度线性化载体；将线性化载体与基因组文库进行体外组装，得到组装产物；在宿主基因中整合入TelN蛋白表达基因，得到整合有TelN蛋白的宿主；将组装产物转入整合有TelN蛋白的宿主中，筛选目标片段。本发明技术具有高效、靶向性强、低成本、大容量、易操作等特点。基于该发明能实现对基因组大片段的高效率一步克隆，实现最大156kb长度基因组序列的克隆。

技术领域

本发明涉及靶向克隆技术领域，特别涉及一种基于线性质粒载体从基因组文库中靶向克隆目标片段的方法。

背景技术

随着高通量测序技术的高速发展，基因组全局信息不断展示在科学家面前，拓宽了生命基因组信息的知识。基因组中被忽视的DNA区域在细胞代谢中发挥着多种功能，揭示了非编码区域和内含子的重要性。这使得以前被称为基因组上的所谓“垃圾序列”慢慢摆脱最初认为的“无作用”的序列。同时，更多新的生物合成基因簇被发现用于有价值的生物抗生素、药物和生物燃料的生产。无论是“垃圾序列”还是次级代谢产物基因通路，往往意味着长度大于常规的基因序列。针对超长基因序列的研究，往往可以更加全面解析编码区内含子或者非编码区序列对基因表达的调控关系。但目标基因组序列往往由于序列长度过长，获取困难，使相关领域专家对完整基因簇研究望而却步。所以，目前急需一种高效获取特定区域基因组序列方法，促进全局基因信息的研究，摆脱以往使用cDNA进行研究基因功能的束缚。

目前获得目标DNA序列的主要方法是基因合成或克隆。随着合成生物学的出现，DNA合成技术实现重大技术飞跃，在实验室就可以合成上百万对碱基对。尽管如此，超长DNA的合成需要花费大量的时间和精力。传统的DNA序列获取方法包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和基因克隆。常规PCR反应一般使用提取的基因组为模板，通过引物在特定基因序列区域进行扩增，一般最大扩增长度为10kb，这远远不能满足需求，并且PCR对重复序列或者复杂序列扩增能力一般。

因此，目前对完整基因的研究一直依赖于BAC或YAC文库。YAC文库依赖酵母宿主的同源重组能力，虽然克隆片段较大，但是对片段的克隆和保存没有BAC文库稳定。然而，目前BAC文库不完整，同时购买和筛选耗时耗力，对于大部分意向基因仍难以从商业化的BAC库中获得。

为了满足大基因簇的需要，近年来出现了许多针对特定基因组片段的克隆方法。比如，TAR克隆(transformation-associated recombination)是利用具有同源重组能力的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主，将YAC载体与酶切基因组片段混合，通过原生质体转化法转至酿酒酵母内。载体与目标片段末端带有一定长度的同源基因序列，在酿酒酵母体内具有同源序列的载体与特定片段组装成YAC质粒。同时，带有目的DNA序列的质粒需要电转化到大肠杆菌内扩增进一步增加产量。TAR克隆效率低，对复杂序列克隆困难。

大肠杆菌相较于酿酒酵母宿主，对片段的保存更加稳定，这是目前对未知生物高通量测序普遍使用BAC文库的主要原因。对于大肠杆菌宿主，近些年开发了CATCH(Cas9-Assisted Targeting of CHromosome Segments)，CAPTURE(Cas12a-assisted precisetargeted cloning using in vivo cre-lox recombination)，ExoCET(ExonucleaseCombined with RecET recombination)等靶向克隆技术。CATCH技术主要改进对目标基因序列的获取方式，使用CRISPR/Cas9系统对需求序列进行靶向剪切，得到目标序列，然后体外使用传统的Gibson assembly组装，电转入大肠杆菌宿主中，由抗性培养基和PCR筛选出阳性克隆。但CATCH克隆技术需要专门设计CRISPR系统，步骤繁多，存在脱靶风险以及剪切效率问题，并且一次只能靶向一段序列。