[发明专利]一种H3亚型犬流感病毒株、灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种 H3 亚型犬流感病毒株，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.20649。

2.一种 H3 亚型犬流感病毒灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗由权利要求1所述 H3 亚型犬流感病毒接种 SPF 鸡胚，收获鸡胚尿囊液，灭活，添加佐剂而得；

包括如下步骤：

（1）接 种 ：将 H3 亚型犬流感病毒经尿囊腔途径按照 2×10⁴EID₅₀/枚的剂量接种于10~11日龄 SPF 鸡胚，35℃孵育；

（2）孵育和观察：接种后 48 小时内，每日照蛋1 次，将 48 小时内死胚弃去，接种后48小时的活胚取出置于 2~8℃冷却过夜；

（3）收获：将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，无菌剥除气室部卵壳，吸取尿囊液，离心取上清液存于 2~8℃即为病毒原液；

（4）浓缩与洗涤病毒原液：将步骤（3）收获得到的病毒原液用超滤浓缩设备浓缩至原来体积的 1/5，所述超滤浓缩设备为100KD~300KD超滤膜包；然后加入等体积的 pH 值为 7.0~7.2 的 PBS 溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复1~ 3 次， 得到浓缩病毒液；

（5）灭活病毒：向步骤（4）所得的浓缩病毒液，加入浓缩病毒液总体积0.1%的甲醛在 4℃振荡灭活 7 日；

（6）柱纯化：将步骤（5）所得灭活好的浓缩病毒液经Capto Core 700柱纯化，流速1mL/min，得到纯化好的抗原，该抗原血凝效价不低于 1:512，最后蛋白含量不高于 400μg/mL，冻干保存；

（7）疫苗配制：使用前，将步骤（6）所得冻干抗原用生理盐水进行稀释，与 Montanide^TMGEL 02佐剂混合，搅拌混匀，得到疫苗。