[发明专利]一种叶子鱼小肽的发酵酶解制备方法及其应用

权利要求书

1.一种叶子鱼小肽的发酵酶解制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）预处理：将叶子鱼粉碎、脱脂、水解，得水解液；其中，所述脱脂为将叶子鱼破壁粉碎至泥状后，向其中加入质量比为2.5%-4%的石油醚脱脂2-4 h，得脱脂鱼粉；所述水解为向所述脱脂鱼粉中加入水，在30~60rpm下，搅拌1~4h；其中，所述脱脂鱼粉与水的质量比为5-6：20；

（2）酶解：以复合酶对步骤（1）所得水解液进行酶解，得到酶解液；所述复合酶包括下述质量分数的酶：碱性蛋白酶20%~25%、胃蛋白酶10%~20%、肠蛋白酶10%~20%、肠激酶10%~20%、乳杆菌氨肽酶10%~20%和金属羧肽酶10%~20%；所述酶解为先用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、肠蛋白酶、肠激酶酶解8-12h，调节pH值为7.8-8.9，温度为50-65℃；再加入乳杆菌氨肽酶和金属羧肽酶酶解6-9h，调节PH值为6.8-7.5，温度控制在50-65℃；酶解结束后，迅速升温到75-80℃，并维持0.5-1.0 h，然后降温至25-37℃；

（3）发酵：用微生物对步骤（2）所得酶解液进行发酵，得发酵液；所述微生物的添加量为酶解液质量的4-5%；所述微生物包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌，三者的丰度均为2.0×10⁸~3.0×10⁸cfu/mL，且体积比为1:1:1；发酵温度为32-40℃，发酵时间为18-20 h；

（4）过滤二次处理：对步骤（3）所得发酵液进行过滤，收集上清，获得粗肽液；然后收集杂质，重复步骤（2）和（3）的过程并过滤再次得到粗肽液；所述过滤为以截留分子量为1500Da的滤膜进行过滤；

（5）纯化分离：用G-15葡聚糖凝胶柱对步骤（4）所得粗肽液纯化，再用凝胶色谱分离得到氨基酸片段为天冬氨酸-精氨酸-组氨酸-赖氨酸的小肽液；所述纯化为使用葡聚糖凝胶柱和超纯水对步骤（4）所得滤液进行洗脱，洗脱速度为1 mL/min，上样浓度为100 mg/mL，收集保留时间为85.21-104.90 min的层析液；

所述分离为将所得层析液脱盐冻干后用NaCl梯度洗脱并置于-4℃冻干，后将其溶解于0.1%三氟乙酸溶液中，采用反相色谱柱分离，流动相为甲酸、水和乙腈，检测波长228 nm，流速1 mL/min；收集最高出峰时间的洗脱液,为确定小肽结构，取适量洗脱液利用质谱仪鉴定肽的二维质谱，缓冲液为TFA和乙腈，空白对比为CHCA溶液；所用波长355 nm，电压20 kV，扫描范围300~3500，设定程序为阳离子及自动获取模式进行数据采集，对比NCBI数据库，得出本发明的小肽序列为天冬氨酸-精氨酸-组氨酸-赖氨酸；

（6）制备：将步骤（5）所得小肽液干燥并除潮，得叶子鱼小肽；所述干燥为喷雾干燥；所述除潮为在干燥后的小肽表面喷涂油脂进行防潮；其中，喷雾干燥的热风进口温度为200~210℃，出风温度为75~85℃，干燥后所得小肽含水量10%；干燥后，过振动筛，除杂。

2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的叶子鱼小肽在制备断奶仔猪日粮中的应用。