[发明专利]一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法

权利要求书

1.一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采集、冻存、传代外周血干细胞；

2)根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；

3)sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GGCGAGTGAGGAGGCGGGCG，具体步骤包括：

a.将寡核苷酸双链连接到pX330载体上，再将连接产物转化至E coli DH5α感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；

b.将之前构建好的sgRNA与Cas9共表达的91个载体分别转染至293T细胞中；

c.提取步骤b细胞的mRNA，反转录为cDNA，用设计好的引物进行PCR；

d.酶切步骤c中的PCR产物；

e.通过是否有切开后的相对小的两条目的条带以及被切开的条带所占的比例选择切割效率最高的sgRNA；

4)将步骤3)中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK-puro质粒电转到外周血间充质干细胞；

5)基因敲除验证；

6)将基因敲除细胞进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR引物序列为PrimerF:TTGGAAGAGGGTGGGTTG，Prime rR:TGTCTGAGTCAAGATGGAGA。

3.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR反应体系为2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Su per-Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，PrimersF 2μL，PrimersR 2μL，cD NA 1μL，ddH₂O补足50μL。

4.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR反应程序为：98℃预变形3min；(98℃变性15s；65℃退火15s；72℃延伸1min；2-4步共35个循环)；72℃延伸5min。

5.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，其特征在于，所述基因敲除验证使用T7核酸内切酶Ⅰ进行。

6.根据权利要求1所述的一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的应用，其征在于，所述的BMP7基因缺失外周血间充质干细胞，用于筛选促成骨形成药物。