[发明专利]一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法

说明书

本发明涉及一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，具体步骤包括：1)根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；2)sgRNA活性检测，确定最优sgRNA，最优sgRNA序列为GGCGAGTGAGGAGGCGGGCG；3)将步骤2)中切割效率最高的sgRNA和嘌呤霉素抗性的PGK‑puro质粒电转到外周血间充质干细胞；4)基因敲除验证；5)将基因敲除质粒进行测序，本发明构建的BMP7基因缺失外周血间充质干细胞，可用于筛选促成骨形成药物。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于成体干细胞的一种，主要来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、自我增殖和多向分化的能力，可分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、施万细胞等，存在于外周血、骨髓、脐带血、皮肤、胎盘、羊水、牙髓等，其中骨髓组织中的含量最为丰富，外周血间充质干细胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PBMSCs)相对于骨髓间充质干细胞具有以下优点：1.来源更加广泛；2.取材更加方便，临床上可操作性强；3.取材过程中减少组织损伤，降低局部组织感染的风险；4.降低医疗成本，减轻患者经济负担。

骨形成因子蛋白可以诱导骨形成，在组织胚胎发育、细胞的生长、分化、迁移凋亡中具有关键作用。骨形成因子7(BMP7)是TGF-β超家族的一员，其具有重要的生物学功能，不仅促进骨的再生，而且对肾脏高糖损伤和纤维化具有重要的保护功能，其在动物发育调控和器官生成、乳腺和前列腺肿瘤的发生发展等过程中起着重要的调控功能。

将外周血充质干细胞的BMP7基因缺失，可以抑制其向成骨细胞分化，利用此模型，可以筛选促成骨形成药物，也可以研究BMP7的信号通路。

发明内容

本发明的目的是建立BMP7基因缺失的外周血间充质干细胞；

本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为ACACCGGCGAGTGAGGAGGCGGGCGG(Seq ID No.1)AAAACCGCCCGCCTCCTCACTCGCCG(Seq IDNo.2)，使用该试剂盒可以用于BMP7基因表达的沉默。

进一步的，本发明提供一种BMP7基因缺失外周血间充质干细胞的建立方法，所述方法包括：

1.采集、冻存、传代外周血干细胞；

2.构建BMP7基因敲除外周血干细胞

2.1根据BMP7基因序列，设计sgRNA序列；

在NCBI上查询人BMP7基因序列(NM_001719，Seq ID No.3)，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计BMP7靶位点；

2.2sgRNA活性检测，确定最优sgRNA；