[发明专利]一种测定噬菌体对抗生素敏感性的方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法。本发明评价方法建立了菌液OD₆₀₀与菌量、菌液用量及噬菌体效价之间的关系，可保证菌液用量满足噬菌体效价的测定，评价结果稳定且可信度高，可用于指导养殖者选择适宜的噬菌体和适宜浓度的抗生素联用，进行科学养殖，进而有效地抑制养殖过程中病原菌的生长，大大降低了人力成本，显著提高了经济效益。

技术领域

本发明涉及生物分析检测技术领域，尤其涉及一种测定噬菌体对抗生素敏感性的方法。

背景技术

采用抗生素治疗细菌性疾病是公认的有效方式；但抗生素长期使用会打破肠道菌群平衡，破坏肠道屏障，进而影响动物免疫力，导致疾病难以控制。2015年华中农大刘建华教授和中国农大沈建忠教授联名发表关于硫酸粘杆菌耐药性的文章，证明了人类病原菌的耐药性与动物使用促生长抗生素有关。耐药菌可通过食物链从动物传递到人类，每年有超过2万人死于超级细菌，所以我国2016年开启了抗生素禁用之旅。

噬菌体可以感染并裂解相应的宿主菌，具有特异性强、自我增殖快、繁殖能力强等优点，且噬菌体会随着宿主的死亡而死亡，动物体内不会有残留，与抗生素相比更加的安全。近年来，噬菌体在畜禽群细菌性疾病的控制与治疗方面取得许多成果，越来越受到人们的关注。

巴氏噬菌体可用于治疗猪巴氏杆菌病，但实际养殖中，在利用巴氏噬菌体治疗猪巴氏杆菌病的同时存在使用抗生素的现象，故需要评估猪养殖过程抗生素是否会对噬菌体的杀菌效果产生影响，检测噬菌体效价在抗生素的干扰下会发生怎样的变化。

对于噬菌体效价的测定，现有技术多采用双层平板法，即先在培养皿中倒入底层固体培养基，待其凝固，倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。37℃培养一段时间后，统计噬菌斑的数量；或者是将一定体积的菌液与培养基混合后倒在底层固体培养基上，制备双层平板，待其凝固后，滴加2-5μL噬菌体，37℃培养一定时间后统计噬菌斑的数量。如肖迨等(2017)采用双层平板法检测噬菌体JDOO7的效价，但无法保证金黄色葡萄球菌液在平板表面是均匀涂布的，会造成计数误差；钟文诗等(2020)在进行驴源噬菌体效价测定时，铺双层平板时菌液用量仅100μL，且不同批次菌液浓度有异，若定量实验用菌液体积，会造成重复性实验之间较大的误差。双层平板法有以下不足之处：第一，噬菌体活性易受影响。已有实验证明，温度对噬菌体的效价影响较大。在制备双层平板时，将噬菌体与菌液混匀后加入55℃半固体培养基中使其凝固，但此时对于温度的把控难度较大，偏高，易影响噬菌体活性，偏低，会导致培养基结块，细菌与噬菌体分布不均匀；第二，菌液的用量不统一；多数实验会直接加入一定量菌液，比如100μL，但这种操作实验重复性较差；也有以MOI比值为参照加液，但每次实验均要检测细菌和噬菌体的MOI值，实验周期长，操作复杂；第三，噬菌体用量不合理；问题除同第二点所述外，大多还需要对噬菌体进行稀释梯度，梯度设置不合理会造成以下两种情况：噬菌斑较多，连在一起无法计数；或噬菌斑较少，计数差异大。因此，提供一种准确可靠的评估抗生素对噬菌体杀菌效果影响的方法用于指导养殖户安全养殖，有效提高养殖业的经济效益具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法。本发明提供的方法可准确测定噬菌体对抗生素敏感性，可用于指导养殖户安全养殖，提高养殖业的经济效益。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法，包括：

1、一种噬菌体对抗生素敏感性的评价方法，其特征在于，包括：

步骤1：将噬菌体接种至含抗生素的生理盐水中，培养0～72h，分别取0h、24h、48h、72h的培养液，得待测样液；

步骤2：将噬菌体接种至不加抗生素的生理盐水中，培养0～72h，分别取0h、24h、48h、72h的培养液，得对照样液；