[发明专利]气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究及其应用

权利要求书

1.一种气体神经保护剂，其特征在于，为氩氧混合气，其中，氩气与氧气的浓度分配比为79:21。

2.一种气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、建立缺血性脑卒中的动物和细胞模型；

S2、在细胞模型上观察氩气对脂多糖刺激的原代小胶质细胞炎症激活的影响和分子机制；

S3、探讨氩气对小胶质细胞活化中NLRP3炎症小体的调控在脑缺血再灌损伤的神经保护中作用。

3.根据权利要求2所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤为：

S1.1、建立缺血性脑卒中动物模型采用的动物模型为缺血再灌注模型，实验分为四个组：假手术组：结扎右侧颈总动脉血流，再灌注时松开结扎部位；脑缺血再灌注组：右侧大脑中动脉栓塞3h后取出线栓；氩气组：在tMCAO术后1h采用氩氧混合气治疗3h；NLRP3炎症小体抑制剂MCC950组：分别在tMCAO组的小鼠缺血1h和3h时进行腹腔注射MCC950；

具体手术过程为：将成年雄性ICR小鼠异氟烷麻醉后，仰卧固定在鼠板上，消毒，颈中正线开口，用弯头镊子进行钝性分离，沿胸锁乳突肌内缘三角区分离肌肉筋膜，分离出颈总动脉，颈内动脉，颈外动脉，并电离颈外动脉；颈总动脉近心端结扎，颈内动脉接近颈总分叉处用动脉夹阻断血流，在颈外动脉远端剪开一小口，将头端用硅胶包裹的尼龙线插入；松开动脉夹，将线栓从颈内动脉推入大脑中动脉起始端，结扎固定；手术过程小鼠体温保持37℃，大脑中动脉栓塞一定时间后缓慢拔出尼龙线，电凝颈外动脉并松开颈总动脉，实现再灌注；

S1.2、建立细胞炎症反应模型使用C57BL/6红皮鼠进行原代培养小胶质细胞：将C57BL/6红皮鼠断头处理取出脑组织，使用弯镊剥离海马组织，取皮层，37℃胰酶消化12分钟，取出后使用3ml培养基终止消化，并清洗2次；使用1ml枪头将含有培养基的脑组织吹打混匀，离心12000rpm、5min，离心结束后，去上清，加入培养基进行重悬，吹打均匀后种于T75培养瓶中，一星期后加入含有生长因子的培养基，再培养一周可收集原代培养小胶质细胞；将含有原代小胶质细胞的培养瓶置于37℃摇床，将培养瓶中的上清液转移至15ml离心管中，离心12000rpm、5min，使用1ml培养基重悬，进行细胞计数，种于小皿中于37℃培养箱中培养，细胞密度在5x10⁵-1x10⁶，在接种后24h之内使用。

4.根据权利要求2所述的气体神经保护剂对NLRP3炎症小体起抑制作用的研究方法，其特征在于，步骤S2的具体步骤为：

S2.1、通过RT-qPCR和Western Blot技术检测原代培养小胶质细胞中NLRP3炎症小体的表达情况；

S2.2、进行体外LPS刺激原代培养小胶质细胞炎症反应模型的实验，实验分组为Con组，LPS组和+iAr₂+LPS三个组：对照组，对照组细胞不做任何处理，直接置于培养箱中培养3h，结束后加入裂解液进行后续处理；LPS组是在小皿中加入40μl 100ng/ml的LPS刺激3h，刺激期间始终置于37℃培养箱里培养，结束后同样加入裂解液进行后续处理；氩气组是在LPS组的基础上，加入LPS之后立即放入氩气舱进行氩氧混合气治疗3h，氩气舱中使用37℃循环水浴保持舱内温度，氩气治疗结束后加入80μl RIPA裂解液或者300μl TRIZOL裂解液进行后续处理；采用RT-qRCR和Western Blot技术，检测LPS刺激3h后在小胶质细胞中NLRP3炎症小体的表达情况。