[发明专利]一种用于靶向FFPE RNA建库的方法

权利要求书

1.一种用于靶向FFPE RNA建库的方法，其步骤包括：

（1）FFPE RNA的片段化；

（2）片段化的FFPE RNA的3´末端加poly（A）多聚核酸；

（3）1^st cDNA的合成；

（4）靶向区域基因的富集扩增；

（5）文库扩增。

2.根据权利要求1所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（1）FFPERNA的片段化，将FFPE RNA片段化到150~200bp。

3.根据权利要求2所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（2）中片段化的FFPE RNA的3´末端加poly（A）多聚核酸使用的是Poly（A）聚合酶。

4.根据权利要求1-5中任一项所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（2）中在37℃ 10min完成FFPE RNA末端添加27~33个poly（A）。

5.根据权利要求5所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（2）中使用的1X Poly(A) Polymerase Reaction Buffer为50 mM Tris-HCl，250 mM NaCl，10 mMMgCl2，pH 8.1。

6.根据权利要求1所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（3）中1^stcDNA的合成体系包括：步骤（2）得到的FFPE RNA片段、buffer、dNTP 、Oligo-dt30v引物、T-Primer引物、逆转录酶和Murine RNase Inhibitor鼠源RNase抑制剂，其中Oligo-dt30v引物序列为：5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3´，T-Primer引物序列为：5´--AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGr+G-3´。

7.T-Primer引物末端进行锁核酸修饰

根据权利要求2所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（3）中1stcDNA的合成体系使用的逆转录酶为Hifair® IV Reverse Transcriptase或Hifair® ⅢReverse Transcriptase。

8.根据权利要求3所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（3）中1stcDNA的合成体系使用的反应缓冲液5×RT Buffer为：250mMTris-HCl，375 mM KCl，28 mMMgCl2，pH 7.9 。

9.根据权利要求1所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（4）具体为：对靶向基因进行上游特异性引物设计，然后利用上游特异性引物和下游引物进行多重PCR以实现靶向区域基因的扩增富集，其中上游特异性引物设计由接头序列加特异性引物组成，所述接头引物为测序平台的测序引物，所述特异性引物的设计原则为：长度在15-30nt，连续碱基数目不超过3个，GC含量在35%-65%之间，Tm值在55℃-63℃之间，部分特殊区域Tm会略高或略低；引物不含有自身互补序列，没有明显的二级结构，邻近引物识别位点间隔40bp 且100bp；下游引物序列为： 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTNNNGNNCNNNGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3´,其中TNNNGNNCNNN是UMI标签。

10.根据权利要求1所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（4）中使用的扩增酶是：2×Hieff NGS® HG Multiplex PCR Master Mix 2×高GC多重PCR预混液，翊圣，Cat. 13283。

11.根据权利要求1所述的用于靶向FFPE RNA建库的方法，其特征在于：步骤（5）中使用的文库扩增酶是2×Super Canace® II High-Fidelity Mix for LibraryAmplification，翊圣，Cat. 12621。