[发明专利]一种用于靶向FFPE RNA建库的方法

说明书

本发明提供一种用于靶向FFPE RNA建库的方法，其步骤包括：对样本进行FFPE RNA的片段化，使FFPE RNA大小主要集中到150~200bp；在片段化后的FFPE RNA末端添加poly（A）多聚核酸；使用逆转录酶，以末端加A的FFPE RNA为模板，进行1st cDNA的合成；对合成的1st cDNA进行靶向区域基因的富集处理；文库扩增。本发明方法是利用带有接头序列的特定引物直接在1st cDNA上进行目标区域的扩增，然后通过PCR实现完整的测序文库，直接对目标区域进行扩增建库测序使得目标区域更集中，建库流程较为简单，时间短，数据利用率高，成本低。

技术领域

本发明专利涉及一种用于靶向FFPE RNA建库的方法。

背景技术

经过福尔马林固定，蜡块包埋后的肿瘤组织的FFPE样本是临床研究的重要资源，可以用于组织学诊断，还能进行NGS测序分析基因表达，可变剪接融合基因等信息。但是福尔马林和蛋白交联会影响核酸的提取，抑制聚合酶等活性，高温渗入的石蜡会降低核酸的质量。而且RNA相比DNA更容易降解，因此FFPE RNA的完整性差，品质低。总RNA中约有90％是核糖体RNA(rRNA)，因此FFPE RNA样本的RNA-seq面临严峻的挑战。

对于FFPE RNA样本的RNA-seq建库策略一般时间较长，大约8～10h，要经过rRNA的去除，然后再进行RNA的片段化、1st cDNA合成、2nd cDNA的合成、末端修复、接头连接及文库扩增等过程复杂。通常还要进行捕获测序才能得要研究者想要的遗传信息，因此需要较高的测序量。这样的建库策略耗时长，成本高，对样本的质量和投入量等有较高要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于靶向FFPE RNA建库的方法，能实现对较低质量和较少起始量的FFPE RNA的建库策略。

本发明采用的技术方案为：一种用于靶向FFPE RNA建库的方法，其步骤包括：

(1)FFPE RNA的片段化；

(2)片段化的FFPE RNA的3′末端加poly(A)多聚核酸；

(3)1^st cDNA的合成；

(4)靶向区域基因的富集扩增；

(5)文库扩增。

优选的，步骤(1)中FFPE RNA的片段化，是利用Mg²⁺进行不同程度的片段化。

更优选的，步骤(1)中FFPE RNA的不同程度的片段化，是利用高温孵育时间的长短来完成不同质量度FFPE RNA的片段化。

优选的，步骤(2)中片段化的FFPE RNA的3′末端加poly(A)多聚核酸使用的是Poly(A)聚合酶。

更优选的，步骤(2)中片段化的FFPE RNA的3′末端加poly(A)多聚核酸反应程序是：37℃10min完成末端添加27～33个poly(A)。

更优选的，步骤(2)中片段化的FFPE RNA的3′末端加poly(A)多聚核酸反应缓冲液是：1X Poly(A)Polymerase Reaction Buffer为50mM Tris-HCl，250mM NaCl，10mM MgCl2，pH 8.1。