[发明专利]一种同时检测猪肉中磺胺类、氟苯尼考、替米考星和甲氧苄啶的快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种同时检测猪肉中磺胺、氟苯尼考、替米考星和甲氧苄啶的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：反应液A，反应液B，阴性对照液，浓缩清洗剂，显色剂A，显色剂B，停止剂，预混孔板，反应孔板。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液A为磺胺、氟苯尼考、替米考星、甲氧苄啶单克隆抗体混合工作液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述混合工作液由反应液A稀释液稀释得到；

每1000ml所述反应液A稀释液的配方为：100ml 0.5M EDTA，900ml 0.02M硼酸盐缓冲液，0.05% 环糊精，0.05% 酪蛋白钠，0.10% Triton X-100，0.05% 叠氮钠，0.10% 海藻糖，0.05% 聚乙二醇，0.05% 聚丙烯酰胺，0.05% 乳清蛋白。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，

所述混合工作液中磺胺、氟苯尼考、替米考星、甲氧苄啶单克隆抗体的稀释倍数为：磺胺1/25W、氟苯尼考1/8W、替米考星1/6.8W、甲氧苄啶1/30W。

5.根据权利要求4所示的试剂盒，其特征在于，所述氟苯尼考单克隆抗体的抗原制备方法如下：

A.半抗原合成

（1）称取500mg氟苯尼考原药，加入6ml吡啶，搅拌至全部溶解，加入153mg HS，加热到60度，通过TLC发现反应没有变化时，旋干吡啶，用甲醇溶解，加入硅胶进行拌样，旋干样品进行柱层析，收集所需要的溶液，旋干，得450.2mg氟苯尼考半抗原；

B.免疫原制备

（1）将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5ml DMF溶解，加入25.75mg EDC，15.46mg NHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到氟苯尼考免疫原反应液；

（2）称取50mg BSA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中充分溶解，冰浴降温至0-4℃搅拌，将氟苯尼考免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到氟苯尼考免疫原；

C.包被原制备

（1）将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5ml DMF溶解，加入25.75mg EDC，15.46mg NHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到氟苯尼考包被原反应液；

（2）称取33.6mg OVA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，使其充分溶解，冰浴降温至0-4℃搅拌，将氟苯尼考包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到氟苯尼考包被原；

所述氟苯尼考半抗原的结构式为：

；

所述磺胺单克隆抗体的抗原制备方法如下：

A.半抗原合成

（1）称取500mg氢氧化钠，用6ml水在冰浴下溶解，称取600mg氨基苯甲酸，加入其中，搅拌，分批加入700mg乙酰苯胺磺酰氯，点板监测反应；

（2）反应完后PH值调节为 2，粘稠物析出后用乙醇溶解，70%的乙醇重结晶，冷却析晶过夜，过滤，得到580mg中间体；

（3）用8ml甲醇溶解580mg中间体，加入5ml盐酸，点板监测反应，反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节PH值为7，萃取，旋干收集到的溶液得到430mg磺胺半抗原；

B.免疫原制备

（1）将5.55mg磺胺半抗原用1.5ml DMF溶解，加入0.98mg HCl，4.5mg NaNO₂溶解，室温搅拌活化2-3h，得到磺胺免疫原反应液；

（2）称取20mg BTG溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中充分溶解，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将磺胺免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入净透析袋, 2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到磺胺免疫原；

C.包被原制备

（1）将20.6mg磺胺半抗原用1.5ml DMF溶解，加入3.65mg HCl, 16.8mg NaNO₂溶解，室温搅拌活化2-3h，得到磺胺包被原反应液；

（2）称取50mg OVA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中使其充分溶解，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将磺胺包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到磺胺包被原；

所述磺胺半抗原的结构式为：

；

所述甲氧苄啶单克隆抗体的抗原制备方法如下：

A.免疫原制备

（1）将5.19mg甲氧苄啶原料用1.5ml DMF溶解，加入10.3mg EDC, 6.18mg NHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到甲氧苄啶免疫原反应液；

（2）称取20mg KLH溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将甲氧苄啶免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到甲氧苄啶免疫原；

B.包被原制备

（1）将19.3mg甲氧苄啶原料用1.5ml DMF溶解，加入38.34mg EDC, 23.02mg NHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到甲氧苄啶包被原反应液；

（2）称取50mg OVA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将甲氧苄啶包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将反应产物装入透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到甲氧苄啶包被原；

所述替米考星单克隆抗体的抗原制备方法如下：

A.免疫原制备

（1）将15.56mg替米考星原料用1.5ml DMF溶解，加入3.05mg CDI溶解，室温搅拌活化2-3h，得到替米考星免疫原反应液；

（2）称取20mg KLH溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将替米考星免疫原逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，,2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到替米考星免疫原；

B.包被原制备

（1）将57.9mg替米考星原料用1.5ml DMF溶解，加入11.34mg CDI溶解，室温搅拌活化2-3h，得到替米考星包被原反应液；

（2）称取50mg OVA溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将替米考星包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；

（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L 0.01M PBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到替米考星包被原。