[发明专利]一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法

权利要求书

1.一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，制备步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、乳双歧杆菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基中进行活化培养，分别得到枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；

(2)将豆粕、豆渣和次粉混合均匀，得到厌氧发酵培养基：

(3)接种步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、乳双歧杆菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液分别加入步骤(2)得到的厌氧发酵培养基中，混合均匀，得到厌氧发酵混合物，调整发酵温度以及培养基含水量，在密封条件下进行厌氧发酵，厌氧发酵后获得成品，即为富含乳双歧杆菌发酵饲料；

(4)制作乳双歧杆菌标准曲线:将乳双歧杆菌基因组DNA用乳双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×10²～1×10⁹拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应，记录荧光定量PCR反应过程中产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，即为Ct值；将测得的标准品DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成标准曲线；

其中拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10^-9×6.023×10²³/(660×碱基数)；

(5)取步骤(3)制备的一定量饲料样品，提取DNA进行qPCR检测，得到Ct值，根据步骤(4)所得标准曲线计算乳双歧杆菌数量。

2.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(1)所述乳酸菌为凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌或乳双歧杆菌的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述厌氧发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：

豆粕37％～52.5％；

豆渣40％～55.5％；

次粉7.5％～19.5％。

4.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌种子液和酿酒酵母种子液的接种量均为厌氧发酵培养基重量的1％～3％；所述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的活菌总数均为1.0×10⁸～2.1×10⁹cfu/mL。

5.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳双歧杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的2％～4％，所述乳双歧杆菌种子液的活菌总数为1.3×10⁸～2.7×10⁹cfu/mL。

6.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳酸菌种子液包括凝结芽孢杆菌种子液、副干酪乳杆菌种子液的一种或多种；凝结芽孢杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的4％～6％，所述凝结芽孢杆菌种子液的活菌总数为2.5×10⁸～5.3×10⁹cfu/mL；副干酪乳杆菌种子液的接种量为厌氧发酵培养基重量的1％～4％，所述副干酪乳杆菌种子液的活菌总数为1.1×10⁸～3.7×10⁹cfu/mL。

7.根据权利要求1所述的一种富含乳双歧杆菌发酵饲料的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵的温度为25～38℃，时间为5～30天；所述调整培养基的含水量为40％～60％。