[发明专利]一种表达糊精脱支酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达糊精脱支酶的基因工程菌及其应用，属于食品、生物技术领域。本发明成功构建了含有编码基因的重组表达载体，从而获得基因工程菌株，可高效表达新型的糊精脱支酶，采用本发明制备得到的糊精脱支酶热稳定性好，酶活高，pH耐受性好，满足淀粉糖生产过程中糖化反应对其温度和pH的要求，在60‑65℃条件下，糊精脱支酶依然具有较高的催化水解能力，可将糖化酶和糊精脱支酶一起加入进行反应，大大降低了生产工艺的难度和生产成本、减少糖化酶用量，节省糖化时间。

技术领域

本发明涉及一种表达糊精脱支酶的基因工程菌及其应用，属于食品、生物技术领域。

背景技术

目前，淀粉脱支酶主要分为两类：包括普鲁兰酶(EC3.2.1.41)和异淀粉酶(EC3.2.1.68)。普鲁兰酶和异淀粉酶分布较广，与淀粉的水解密切相关。它们可以专一、高效地催化水解普鲁兰糖、支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，因此在工业中的应用非常广泛，但它们的底物特异性存在很大的差异，普鲁兰酶对普鲁兰和β-极限糊精有显著水解活力，能够高效地水解普鲁兰多糖，但是对大分子量的支链淀粉的水解活力较低，对分支非常密集的糖原几乎没有水解作用。异淀粉酶对支链淀粉和糖原表现出较高的水解活力，对小分子量的分支糊精水解活力较低，且不能水解普鲁兰多糖。Kainuma等比较了Pseudomonas异淀粉酶和Klebsiella普鲁兰酶对底物结构的特异性。发现Pseudomonas异淀粉酶最适底物为高分子量葡聚糖，如马铃薯支链淀粉、牡蛎糖原等；Klebsiella普鲁兰酶对于两个麦芽三糖基或麦芽三糖基与麦芽四糖基之间由α-1,6糖苷键连接的分支寡糖具有明显的水解作用，如普鲁兰、6³-O-α-麦芽三糖基-麦芽三糖、6³-O-α-麦芽三糖基-麦芽四糖等。两种脱支酶最大的区别在于普鲁兰酶仅能以极慢的速度水解异淀粉酶的最适底物，而异淀粉酶几乎不能水解普鲁兰酶的最适底物。

目前在传统的麦芽糖浆生产工艺中使用的酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶，他们无法水解生产过程中产生的糊精，因此，需将普鲁兰酶或异淀粉酶与β-淀粉酶协同水解实现底物的充分脱支，从而显著提高麦芽糖的产率。

近年来，随着我国淀粉糖工业迅速发展，糖化酶和脱支酶复配使用制备淀粉糖的应用非常广泛。在全酶法生产淀粉糖的工艺中，因为受限于糖化酶对α-1,6-糖苷键的水解速率，反应的总转化率往往达不到生产期待值。理论上增加糖化酶用量或降低淀粉浆浓度可以增大转化率，但前者会增加生产的成本；后者需要增大糖化罐体积，将导致蒸发费用和染菌风险的增加，影响企业效益。因此，在糖化阶段加入脱支酶可以减少糖化酶用量，增加淀粉的水解速度、节省糖化时间、增大底物浓度以节省后续蒸发费用。

淀粉糖化通常采用60-65℃的反应温度，因此对脱支酶的稳定性和耐热性要求较高，筛选新型高酶活且具有较好热稳定性的脱支酶，具有重要得多应用意义。液化后的淀粉溶液粘度和分子量大幅度降低，形成不同水解程度的糊精溶液，目前与糖化酶复配的脱支酶中，使用最广泛的是普鲁兰酶，但是该脱支酶的最适反应温度(45℃)低于淀粉糖化温度(60-65℃)，且普鲁兰酶与糖化酶需分开添加，于是在糖化过程中，为提高底物的利用率和增大转化率，需要进行不同阶段的变温控制，将导致生产成本和生产难度的增加。

目前报道的很多微生物来源的脱支酶，如普鲁兰酶和异淀粉酶，存在产量低和高生产成本的问题，造成了商业应用的局限性，这两种酶均存在生产方面的限制，一直以来是被国外垄断的局面，故而筛选出不同底物特异性的脱支酶，提高其表达量以适应更广泛的工业需求具有重要的意义和商业化价值。

发明内容

为了解决现有技术当中脱支酶的稳定性低、产物特异性不高的问题，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为表达宿主，表达了氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的糊精脱支酶。

在本发明的一种实施方式中，以pET-20b(+)、pET-15b或pET-28a为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述糊精脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。