[发明专利]一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及miRNA检测技术领域，具体涉及一种D‑A‑D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用，使用四条退火后的发夹DNA依次修饰DNA四面体，得到D‑A‑D型FRET DNA纳米机器，四条发夹DNA分别为HMg、H1‑FAM、H2‑TAMRA和H3‑FAM。本发明基于HMg剪切与催化发夹放大，构建了D‑A‑D型FRET DNA纳米机器，该纳米机器可实现对miRNA的高灵敏检测和原位荧光成像，增强了荧光FRET效率，提高了检测灵敏度，解决了发夹DNA细胞膜穿透性和生物稳定性差的技术问题。

技术领域

本发明涉及miRNA检测技术领域，具体涉及一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的早期发现对癌症的预防与治疗具有极其重要的意义，但由于早期癌症患者体内肿瘤标志物浓度较低或肿瘤细胞的数量较少，常规方法难以准确检测，寻找代表性的肿瘤标志物、探求高灵敏度的检测手段以及构建新的循环放大探针对构建诊治一体化平台就有了重要意义。

miRNA是一类单链，小的非编码RNA，在多种细胞过程中发挥重要作用，如细胞增殖、肿瘤发生、胚胎发育。研究表明，miRNA的表达失调与各种人类疾病有关，尤其是癌症，与多种miRNA过表达都有关系。因此，miRNA可作为癌症早期诊断的重要标志物。荧光分析法可实现对早期癌细胞中低浓度miRNA的分析，并以灵敏度高、选择性好、操作简单等优点受到分析工作者的青睐，广泛应用于生化分析、药物检测等领域。

发夹DNA常作为荧光探针应用于细胞内检测，但因其较差的细胞膜穿透性和生物稳定性，应用常常受限。基于此，有必要提供一种细胞膜穿透性和生物稳定性更好的纳米机器，以实现更加高效的活细胞成像。

发明内容

针对发夹DNA细胞膜穿透性和生物稳定性差的技术问题，本发明提供一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用，本发明基于HMg剪切与催化发夹（CHA）放大，构建了D-A-D型FRET DNA纳米机器，该纳米机器可实现对miRNA的高灵敏检测和原位荧光成像。

第一方面，本发明提供一种D-A-D型FRET DNA纳米机器的制备方法，使用四条退火后的发夹DNA依次修饰DNA四面体，得到D-A-D型FRET DNA纳米机器，四条发夹DNA分别为HMg（Mg²⁺DNAzyme）、H1-FAM、H2-TAMRA和H3-FAM，HMg的序列如SEQ ID No.5所示，H1-FAM的序列如SEQ ID No.6所示，H2-TAMRA的序列如SEQ ID No.7所示，H3-FAM的序列如SEQ ID No.8所示。

进一步的，包括如下步骤：

（1）分别用Tris-HCl缓冲溶液稀释四条发夹DNA并进行退火处理；

（2）然后退火后的四条发夹DNA依次与DNA四面体比例混合并于37℃下反应，四条发夹DNA与DNA四面体的摩尔比为1：1：1：1：1。

进一步的，步骤（1）具体为：

使用Tris-HCl缓冲溶液将四条发夹DNA分别稀释为1μM的分散液，将四种分散液分别置于95℃下加热5min后自然冷却到室温，完成退火处理。

进一步的，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20mM，pH值为7.4。

进一步的，DNA四面体按照如下方法制得：

将四条寡核苷酸长链依次加入到TM缓冲溶液中得到均匀混合物，加热后立即冷却，得到DNA四面体，四条寡核苷酸长链分别为TDNa、TDNb、TDNc、TDNd，TDNa的序列如SEQ IDNo.1所示，TDNb的序列如SEQ ID No.2所示，TDNc的序列如SEQ ID No.3所示，TDNd的序列如SEQ ID No.4所示。