[发明专利]一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法

权利要求书

1.一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用McCoy细胞进行胞内劳森菌的培养；

(2)制备IPMA反应板：将步骤(1)培养的胞内劳森菌加入到含McCoy细胞的细胞板中进行培养，连续培养4-5d，之后依次进行固定、通透和封闭；

(3)在步骤(2)所得的IPMA反应板中加入待测血清，同时分别加入阳性对照血清和阴性对照血清，孵育；加入过氧化物酶标记的二抗，孵育；加入显色液，反应，干燥；

(4)显微镜下观察，当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；而当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。

2.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胞内劳森菌选自胞内劳森菌LJS19051，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉，保藏日期为2020年7月21，保藏编号为CCTCC NO：V202046。

3.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加至McCoy细胞中培养，之后更换为培养用培养液，进行培养。

4.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)培养的胞内劳森菌先用接种培养液稀释后加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，之后更换为培养用培养液，连续培养4-5d。

5.根据权利要求3或4所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，所述接种培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

6.根据权利要求3或4所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，所述培养用培养液，以培养液总体积计，由以下组分组成：

％代表体积百分比。

7.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的McCoy细胞的密度为30％～35％，在35-39℃，4-6％CO₂培养箱中培养不应超过24h；所述连续培养4-5d，是将培养物置于35-39℃，7-9％O₂、8-10％CO₂和78-88％N₂的微需氧环境下培养。

8.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用多聚甲醛进行室温固定；采用Triton X-100进行室温通透；采用含4-6％BAS的PBST溶液进行封闭。

9.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述阳性对照血清和阴性对照血清，分别选自猪源胞内劳森菌标准阳性血清和标准阴性血清；所述过氧化物酶标记的二抗选自HRP标记的羊抗猪酶标二抗；所述显色液选自AEC显色液，所述反应为避光反应15-25min。

10.根据权利要求1所述的胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述二抗的稀释倍数为1:(500-1500)，优选为1:1000；所述二抗的孵育时间为50-70min，优选为60min；所述显色液显色时间为15-25min，优选为20min。