[发明专利]一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法

说明书

本发明公开了一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，包括以下步骤：(1)利用McCoy细胞进行胞内劳森菌的培养；(2)制备IPMA反应板：将步骤(1)培养的胞内劳森菌加入到含McCoy细胞的细胞板中培养，连续培养4‑5d，之后依次进行固定、通透和封闭；(3)在步骤(2)所得的IPMA反应板中加入待测血清，同时分别加入阳性对照血清和阴性对照血清，孵育；加入过氧化物酶标记的二抗，孵育；加入显色液，反应，干燥；(4)显微镜下观察，当待测血清样品为胞内劳森菌抗体阳性时，则被胞内劳森菌感染的阳性细胞胞质将被染为棕红色；而当待测猪血清样品为胞内劳森菌抗体阴性时，则被胞内劳森菌感染的McCoy细胞胞质不着色。该法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点。

技术领域

本发明属于胞内劳森菌抗体检测技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法。

背景技术

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)，俗称猪回肠炎，是由胞内劳森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)感染引起的以回肠、盲肠、结肠粘膜增厚为主要特征的一种重要猪肠道性疾病。被感染的上皮细胞一般不能发育为成熟的肠上皮细胞，随着时间推移，成熟的肠上皮细胞在衰老后被感染的不成熟的细胞取代，导致受感染动物不具备正常的吸收功能，造成病猪生长发育变缓，饲料转化率下降，养殖成本增加，使养殖户遭受严重的经济损失。据报道，在美国，每年因PPE造成的经济损失高达2000万美元，英国每年的损失约为400万英镑。此外，丹麦、瑞典、越南、菲律宾和日本的养猪场PPE阳性率分别为94％、48％、77％、86％和94％。在韩国、泰国和马来西亚等国家更为严重，患病率高达100％，上述结果表明，PPE在世界各地猪场中普遍存在，已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病，且严重影响养猪业的健康发展。

胞内劳森菌无法在无细胞培养条件下生长，适合其生长的细胞系有Hep-2、IPEC-J2、IEC-18和McCoy等。此外，胞内劳森菌的生长环境极其苛刻，需要在微需氧环境(83.2％N₂，8.8％CO₂和8.0％O₂)中生长。导致全球只有少数实验室具备成功分离、培养胞内劳森菌的能力。因此，胞内劳森菌的分离、培养和鉴定具有一定的困难性。此外，胞内劳森菌的分离、培养和鉴定需要昂贵仪器和专业人员，且缺乏统一的分离、培养和鉴定体系标准，故对胞内劳森菌的研究并不深入。

然而，鉴于PPE严重危害养猪业的健康发展，为攻克这一项重大难题，准确掌握中国PPE流行情况，深入了解PPE在中国的感染率及感染时间点显得十分必要。国内目前对胞内劳森菌的检测主要是以活体诊断方法为主，但该方法目前还不够完善；此外，众多学者分别采用间接ELISA和PCR检测方法对猪血清和猪粪便中的LI抗体及LI抗原进行检测。但间接ELISA法特异性差，检测结果容易产生假阳性；PCR检测方法由于检测限低，加之粪便中存下PCR抑制因子，使得检测结果容易出现假阴性。尽管国外已有商品化的检测猪血清中LI抗体的ELISA试剂盒，至今并未在中国猪场得到广泛应用。免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)已被广泛应用于胞内劳森菌的血清学检测，该方法不需要昂贵试验仪器，成本低，且操作简便，特异性强，灵敏度高，适用于群体化筛查，在国外已被广泛使用。国内，李磊等人使用猪PPE弱毒疫苗中的LI为检测原，成功建立了检测猪血清中LI抗体的IPMA检测方法，该方法可用于评估商品化PPE疫苗的免疫效果。但该研究也存在一定的局限性。例如，与造成猪群感染发病的LI野毒株相比，商品化PPE疫苗中的菌株已经过人工致弱，在一定程度上其与猪群自然感染的野毒株存在差异，因此，以弱毒疫苗为检测源，往往无法反应猪群感染的最真实状态，更无法区分猪血清中的抗体是来自野毒感染，还是疫苗免疫的结果。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种胞内劳森菌的IPMA抗体检测方法，为胞内劳森菌血清流行病学调查及胞内劳森菌疫苗免疫效果评价奠定基础。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：