[发明专利]一种人韧带成纤维细胞的制备方法

权利要求书

1.一种人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括对人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs进行分离纯化以及培养的步骤，其中，所述培养的步骤包括：将加入含有bFGF生长因子或含有TGF-β1生长因子或含有bFGF与TGF-β1生长因子的人无血清间充质干细胞培养基进行培养，定向诱导所述人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs向人韧带成纤维细胞分化。

2.如权利要求1所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的步骤包括：取人胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，清洗后置于培养皿中，加入消化液于摇床上室温消化；收集细胞消化液经过筛网过滤，收集细胞悬液，离心后，去上清。

3.如权利要求2所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述消化液含0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA+0.1％Ⅱ型胶原酶，室温消化90min。

4.如权利要求2或3所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，收集细胞消化液依次经过100μm、70μm、40μm筛网过滤。

5.如权利要求1至4任一项所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述培养的步骤包括：将分离纯化后的人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs加入所述人无血清间充质干细胞培养基，重悬细胞。

6.如权利要求5所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述人无血清间充质干细胞培养基还含有100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。

7.如权利要求5或6所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，将培养皿置于37℃、5％CO₂的饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每3-4天换液一次。

8.如权利要求7所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，14天后收集呈克隆生长的贴壁细胞，并转移入24孔板中培养，每3天换液1次，当细胞长至80-90％时，收集细胞转移入25cm²细胞培养瓶培养，每3天换液一次。

9.如权利要求1至8任一项所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述培养的步骤包括：待细胞生长至接近85％融合时传代，接种于人无血清间充质干细胞培养基中，培养至第3-4代。

10.如权利要求1至9任一项所述的人韧带成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述人无血清间充质干细胞培养基所含bFGF生长因子的浓度为10ng/ml；或者，所述人无血清间充质干细胞培养基所含TGF-β1生长因子的浓度为10ng/ml；或者所述人无血清间充质干细胞培养基所含bFGF和TGF-β1生长因子的浓度均为10ng/ml。