[发明专利]一种人韧带成纤维细胞的制备方法

说明书

一种人韧带成纤维细胞的制备方法，包括对人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs进行分离纯化以及培养的步骤，其中，所述培养的步骤包括：将加入含有bFGF生长因子或含有TGF‑β1生长因子或含有bFGF与TGF‑β1生长因子的人无血清间充质干细胞培养基进行培养，定向诱导所述人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs向人韧带成纤维细胞分化。通过在人无血清间充质干细胞培养基中引入bFGF或TGF‑β1生长因子或bFGF+TGF‑β1联用，对hDMSCs向韧带成纤维细胞分化具有促进作用，hDMSCs在生长因子的作用下细胞活性、增殖能力、合成胶原能力得到增强。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种人韧带成纤维细胞的制备方法。

背景技术

女性盆底功能障碍性疾病(pelvic floordys function，PFD)主要是因妊娠分娩、便秘、长期咳嗽等对盆底支撑组织造成了急性或慢性损伤使其支持功能减弱导致的一系列疾病，主要类型不仅表现为压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)，还表现为盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)。

我国是PFD第一大国，估计有近亿的患者。由于PFD主要发生于中老年人，患者对PFD认识不足，导致就诊率较低；随着中国进入老龄化社会，发病率呈现逐渐增高趋势；且现有的治疗方式，如手术治疗、物理治疗、盆底功能锻炼等，均不能从根本上恢复盆底支撑组织正常的解剖结构及功能，甚至手术治疗后可能出现炎症反应、性交痛、排异等术后不良反应，致使PFD成为影响女性健康的重要妇科疾病，给患者及社会带来巨大的精神、心理压力及财政负担。

在盆底支持组织中，子宫主韧带、骶韧带是最主要的支撑组织，韧带成纤维细胞是子宫主韧带、骶韧带的主要细胞，其分泌的细胞外基质对维持韧带的生物力学性能有重要作用。韧带成纤维细胞分泌的细胞外基质主要为胶原蛋白、弹性蛋白等，胶原蛋白中的I型胶原具有较高的抗张能力，对盆底结构起到重要的支持作用。由于韧带组织血供较差，分泌胶原能力不足，损伤后自身修复功能差，从而使支持功能减弱。使用自体或异体韧带组织培养的成纤维细胞构建组织工程韧带，存在体外扩增速度慢、多次传代后增殖能力丧失、细胞分泌胶原不足、异体移植后存在免疫排斥、感染、伦理等一系列问题，故使用较少。由此可见，寻找新的组织替代物具有十分重要的意义。

人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs(Human decidual mesenchymal stem cells，hDMSCs)因其显著的增殖能力、容易获取，多向分化潜能及定向迁徙至组织损伤部位等优势，受到广泛关注，随着对其作用机制逐步深入研究，证实hDMSCs对组织损伤修复具有重要的作用，成为构建组织工程韧带具有吸引力的、新的细胞来源。

需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

发明内容

本发明的主要目的在于克服上述背景技术的缺陷，提供一种人韧带成纤维细胞的制备方法，以获得细胞活性、增殖能力及合成胶原能力强的人韧带成纤维细胞。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人韧带成纤维细胞的制备方法，包括对人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs进行分离纯化以及培养的步骤，其中，所述培养的步骤包括：将加入含有bFGF生长因子或含有TGF-β1生长因子或含有bFGF与TGF-β1生长因子的人无血清间充质干细胞培养基进行培养，定向诱导所述人胎盘蜕膜间充质干细胞hDMSCs向人韧带成纤维细胞分化。

进一步地：

所述分离纯化的步骤包括：取人胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，清洗后置于培养皿中，加入消化液于摇床上室温消化；收集细胞消化液经过筛网过滤，收集细胞悬液，离心后，去上清。