[发明专利]一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将BsmBI线性化的pHW2000载体与源自A/Puerto Rico/8/1934的PA基因进行in-fusion连接，得初级载体pHW2000-PR8_PA；

（2）利用in-fusion方法依次将CSPS优化序列、2A序列、IL2信号肽序列、SARS-CoV-2RBD序列、CD80序列和PR8-PA基因包装信号序列连接到初级载体pHW2000-PR8_PA上，得到重组载体pHW2000-PR8_PA-RBD；所述SARS-CoV-2 RBD序列包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述PR8-PA基因包装信号序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种重组流感病毒的构建方法，其特征在于，分别将流感病毒的HA基因、NA基因、PB2基因、PB1基因、NP基因、M基因和NS基因序列连接入线性化的基础载体，得7个初级载体，利用八质粒反向遗传系统，将所述初级载体和权利要求1所述重组载体共同转染293T细胞的混合细胞，包装得重组流感病毒。

3.利用权利要求2所述构建方法构建得到的重组流感病毒。

4.权利要求3所述重组流感病毒在制备病毒免疫治疗和/或抗体免疫治疗的药物或疫苗中的应用。

5.一种重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD的构建方法，包括以下步骤：（1）分别将BsmBI线性化的pHW2000载体与源自A/Puerto Rico/8/1934的HA基因、NA基因、PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因进行in-fusion连接，得初级载体pHW2000-PR8_HA、pHW2000-PR8_NA、pHW2000-PR8_PB2、pHW2000-PR8_PB1、pHW2000-PR8_PA、pHW2000-PR8_NP、pHW2000-PR8_M和pHW2000-PR8_NS；

（2）利用in-fusion方法依次将CSPS优化序列、2A序列、IL2信号肽序列、SARS-CoV-2RBD序列、CD80序列和PR8-PA基因包装信号序列连接到初级载体pHW2000-PR8_PA上，得到重组载体pHW2000-PR8_PA-RBD；所述SARS-CoV-2 RBD序列包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述PR8-PA基因包装信号序列如SEQ ID NO.5所示；

（3）将重组载体pHW2000-PR8_PA-RBD与初级载体pHW2000-PR8_HA、pHW2000-PR8_NA、pHW2000-PR8_PB2、pHW2000-PR8_PB1、pHW2000-PR8_NP、pHW2000-PR8_M和pHW2000-PR8_NS等质量混合，转染293T细胞的混合细胞，收集转染上清为E₀代病毒；

（4）将所述E₀代病毒接种至鸡胚尿囊腔，培养48~72小时，收获鸡胚尿囊液，血凝阳性即为包装得到的重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD，所述接种的量为0.2mL/鸡胚。

6.利用权利要求5所述构建方法构建得到的重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD。

7.权利要求6所述重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD在制备预防流感和COVID-19的疫苗中的应用。

8.一种预防流感和COVID-19的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求6所述重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD。