[发明专利]一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用A型流感病毒八个基因片段为骨架包装出带有新型冠状病毒SARS‑CoV‑2表面刺突蛋白受体结合域（SARS‑CoV‑2_RBD）片段的重组流感病毒，此重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的刺突蛋白受体结合区域RBD。本发明所述重组流感病毒rgH1N1（PR8）‑PA‑RBD可作为重组病毒类药物，用于2019新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）的预防；也可作为体外SARS‑COV‑2 RBD等相关抗原表达和体内递呈系统。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用。

背景技术

流感病毒广泛流行于禽类，哺乳动物及人。宿主分布广，变异快，常给人类和动物养殖业如禽类和猪带来较大疾病负担。从病毒分类学讲，流感病毒属于有囊膜的RNA病毒，其RNA为负股，囊膜病毒基因组分节段。

流感病毒基因组由八个分节段的线性基因片段构成（C型流感病毒只有七个基因片段），八个基因片共段编码十个蛋白，分别为：RNA依赖性RNA聚合酶（PB2，PB1，PA），形成核衣壳的核蛋白NP，基质膜蛋白（M1和M2），两个表面膜蛋白（血凝素HA和神经氨酸酶NA），非结构蛋白NS1和核出运蛋白NEP。病毒基因的转录和复制发生于宿主细胞核内，病毒组装和出芽形成于宿主细胞膜。两个不同流感病毒同时感染一个细胞时会发生基因重配。

流感病毒通过其表面糖蛋白HA吸附宿主细胞膜上的唾液酸寡聚糖。病毒粒子被内吞后，HA在内吞小体中发生构象变化，促使膜融合发生，进而使病毒脱掉衣壳。之后核衣壳蛋白移至核小体附近，病毒RNA开始被转录。病毒RNA转录时通过病毒内切酶将宿主细胞异源mRNA的加帽5'-末端剪切掉，使之成为病毒RNA模板被病毒逆转录酶转录的引物。转录子终止于模板末尾15-22个碱基，这些寡聚核苷（U）序列作为加上多聚poly A信号。

流感病毒为分节段RNA病毒，其病毒基因组在宿主细胞核内被复制好后出核并与粗面内质网内翻译加工修饰好的结构蛋白相遇，此时八条病毒RNA （vRNA） 会被包装到一个成熟病毒粒子里然后出芽形成新的具有感染性的子代病毒。目前较为清晰流感病毒包装机制仍不清楚，但已有的研究表明病毒vRNA包装是选择性的，而非随机包装。八个基因片段中每个基因的3'和5'端基因序列作为不同片段的特异性包装信号可使病毒vRNA有序高效的包装到一个病毒粒子，形成子代感染性病毒颗粒。也有研究表明存在少于八个基因片段的病毒粒子，但此类病毒粒子数量少，感染力不确定。

流感病毒在遗传进化过程中产生很多天然基因缺失或插入，但主要以缺失最为普遍。这些缺失或插入对病毒的致病性，宿主范围扩大，新宿主适应都有重要作用。基因缺失主要集中在NA基因和NS1基因，尤其是动物源性流感病毒在感染和适应新宿主的过程中会经常出现，且缺失的具体位置和数目在不同毒株之间会有所差异。插入主要出现在低致病性流感病毒变为高致病性流感病毒时，在HA基因的切割位点/GLF基序前插入多个碱性氨基酸，如RKKR等。此类HA蛋白多个碱性氨基酸的插入只出现在H5和H7亚型流感病毒中。流感病毒这些缺失和插入表明病毒的基因组在这些位置可以容忍变异，因此人们尝试通过缺失的位置改造流感病毒，如NS1基因缺失病毒等。

以往的研究表明利用流感病毒作为载体表达外源蛋白都集中在A型流感病毒基因组出现天然缺失的位置，如神经氨酸酶基因（NA）和非结构蛋白1（NS1）。这些位置出现缺失即表明病毒可以容忍缺失变异，但可以插入的外源基因片段不宜过大，且无需改造3'和5'包装信号，即3'包装信号序列-病毒基因ORF-（2A）外源蛋白基因序列-5'包装信号序列。这样的重组病毒多用于报告病毒系统，即病毒表达GFP或者luciferase等，但是并不适合报告基因以外的较大的外源基因片段。

发明内容