[发明专利]一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法，包括如下步骤，1)将杜仲无菌苗的幼茎或幼叶接种于培养基中培养，诱导得到杜仲愈伤组织，所述培养基中添加有植物生长调节剂；2)将杜仲愈伤组织接种于培养基中培养，得到杜仲悬浮细胞，所述培养基中添加有植物生长调节剂；3)在杜仲悬浮细胞中加入真菌多糖，或真菌多糖和茉莉酸甲酯的混合物，继续培养，得到提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞；本申请可以有效的提高杜仲悬浮细胞中过氧化物酶活力，提高氨基酸等物质的含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种提高有效成分含量的杜仲悬浮细胞培养方法。

背景技术

将诱导形成的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养，得到的物质为悬浮细胞。利用悬浮细胞可以生产出各种次生代谢物质。为了实现悬浮细胞能够生产出高产量的目标代谢产物，一般从几个方面进行改进，比如选育高产细胞系，添加诱导子。

杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究，邱晓芳，江西师范大学学位论文，描述了诱导子的种类，包括糖蛋白类，如糖基化的氧化牛血清白蛋白和氧化溶菌酶，蛋白质类诱导子，如果胶酶及链状蛋白酶，多糖类诱导子，如镰刀菌菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖，微生物类诱导子，如真菌诱导子，金属离子，如铜、钙、镁离子等。

杜仲为名贵中药，其次生代谢产物主要包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、苯丙素类、多糖、酚类、三萜类、甾类、有机酸、氨基酸、微量元素等，其通过试验得到杜仲细胞悬浮系优化得到最佳的培养条件为，B5+0.5mg/L NAA，0.6mg/L 6-BA，3％蔗糖为碳源，pH5.52，培养周期为12天。初始最佳接种量为1.6g·DCW/L。其代谢产物中最大值分别为黄酮16.63mg/g(113.08mg/L)和绿原酸3.93mg/g(26.57mg/L)。杜仲叶片愈伤组织诱导及增殖培养条件的优化，科学技术与工程，第13卷第7期，探讨了6-BA、NAA、2，4-D和PVP四种物质组合对杜仲愈伤组织及细胞的影响。结果表明：(1)这四种物质对杜仲愈伤组织诱导的影响顺序是6-BANAAPVP，对增殖的影响顺序是6-BANAA2,4-D。利用杜仲叶片诱导愈伤组织最佳培养基为MS+0.5mg·L^-16-BA+0.5mg·L^-1NAA+2％PVP。

杜仲细胞培养生产次生代谢物的研究，朱媛，华南理工大学硕士学位论文，研究了添加物对悬浮细胞生长和桃叶珊瑚苷含量的影响，结论表明：糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一，糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和生长量，而且影响其代谢水平和次生代谢物的合成。以蔗糖为碳源时，最适于细胞的生长，且桃叶珊瑚苷含量最大，其它两种碳源的效果都不如蔗糖。但是蔗糖对桃叶珊瑚苷的生成有一定的抑制作用。桃叶珊瑚苷积累的条件初步优化结果为：MS+20g/L蔗糖+pH 5.8+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA，此时桃叶珊瑚苷含最最高可达60mg/L。添加100mg/L水解酪蛋白和15mg/L酵母提取物均能促进桃叶珊瑚苷的合成。绿原酸的含量在第15d达到最高，绿原酸积累的条件初步优化结果为：MS+35g/L蔗糖+pH 5.3+1.0mg/L 6-BA。添加400mg/L水解酪蛋白和10mg/L酵母提取物均能促进绿原酸的合成。前体物的添加对次生代谢物的合成有一定的影响，可对此进行不同浓度梯度的分析，以提高次生代谢物的含量。

H₂O₂对杜仲愈伤组织中黄酮含量及过氧化物酶活性的影响，邓云云等，分子植物育种，2018年，第16卷第3期，研究表明5-10mmol/L H₂O₂培养杜仲愈伤组织10d时总黄酮含量最高，当杜仲愈伤组织培养5-10d、外源H₂O₂浓度为10mmol/L时的POD活性最高。相关性分析表明，杜仲愈伤组织总黄酮含量与POD活性之间的相关系数为r＝0.42061，具有一定的相关性，推测5-10mmol/L H₂O₂可通过提高杜仲愈伤组织中POD酶活性，刺激黄酮的积累。