[发明专利]一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用在审
| 申请号： | 202110635463.5 | 申请日： | 2021-06-08 |
| 公开（公告）号： | CN113549633A | 公开（公告）日： | 2021-10-26 |
| 发明（设计）人： | 刘清岱;刘光辉;鞠云 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/31 | 分类号： | C12N15/31;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12P13/12 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 刘丹舟 |
| 地址： | 300222 天津市河*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 半胱氨酸 转运 蛋白 突变体 及其 生产 中的 应用 | ||
1.一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其特征在于：包括含L-半胱氨酸转运蛋白突变体的重组质粒的构建，其方法步骤如下：
⑴A31V突变体的获得，以SEQ ID NO.2核苷酸序列为模板，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物，进行PCR得到的突变体基因eamBA31V，该突变体基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；
⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒，将质粒命名为PMW118-eamB-A31V。
2.根据权利要求1所述的一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其特征在于：含氨苄氯霉素的LB固体平板浓℃为100mg/ul。
3.一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，其特征在于：应用于产L-半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，具体方法包括：将得到的重组质粒PMW118-eamB-A31V按化学转化法化转至大肠杆菌感受态细胞，5uL质粒PMW118-eamB-A31V在超净工作100uLW3110tnaA yham中，冰种放置30min，42℃水浴90S，冰上放置4min，加入890uLSOC培养基，37℃，200rpm/min复苏30分钟，8000rpm/min离心30s秒，留100ul培养基重悬，涂布于100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，得到重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V。
4.根据权利要求3所述的一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，其特征在于：化学转化法需要的培养基为Luria-Bertani培养基，其组分包括：酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L。
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