[发明专利]一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用

说明书

本发明涉及一种L‑半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其方法步骤包括：⑴A31V突变体的获得，以SEQIDNO.2核苷酸序列为模板，SEQIDNO.3、SEQIDNO.4为引物，进行PCR得到的突变体基因eamBA31V；⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒PMW118‑eamB‑A31V。本发明同时将L‑半胱氨酸转运蛋白突变体应用于产L‑半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，可使大肠杆菌对L‑半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L‑半胱氨酸产量提高18％。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及编码基因应用技术，尤其是一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用。

背景技术

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于食品，生物，农业等领域。L-半胱氨酸的产量从2012年的2770吨增加到2017年的3402吨，平均增长率为420％。

在大规模工业化生产上，L-半胱氨酸主要依靠蛋白质水解产生，由于较低的提取率以及生产中产生的有害气体和浪费问题，市场更青睐合成或生物技术方法生产L-半胱氨酸，其中就包括发酵法，但目前微生物发酵法生产L-半胱氨酸面临着产量不足的问题，缺乏一种高产的L-半胱氨酸工程菌，因此，通过改造L-半胱氨酸转运蛋白，增强胞内L-半胱氨酸的外排，减轻菌种的代谢负担，对微生物发酵生产L-半胱氨酸具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用，在天然L-半胱氨酸转运蛋白EAMB的基础上，通过定向进化技术改造蛋白质分子结构，突变蛋白可使大肠杆菌对L-半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L-半胱氨酸产量提高18％。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，包括含L-半胱氨酸转运蛋白突变体的重组质粒的构建，其方法步骤如下：

⑴A31V突变体的获得，以SEQ ID NO.2核苷酸序列为模板，SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4为引物，进行PCR即得到的突变体基因eamBA31V，该突变体基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；

⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒，将质粒命名为PMW118-eamB-A31V。

而且，含氨苄氯霉素的LB固体平板浓度为100mg/ul。

一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，应用于产L-半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，具体方法包括：将得到的重组质粒PMW118-eamB-A31V按化学转化法化转至大肠杆菌感受态细胞，5uL质粒PMW118-eamB-A31V在超净工作100uLW3110 tnaAyham中，冰种放置30min，42℃水浴90S，冰上放置4min，加入890uLSOC培养基，37℃，200rpm/min复苏30分钟，8000rpm/min离心30s秒，留100ul培养基重悬，涂布于100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，得到重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V。