[发明专利]一种高效的三叶木通倍性检测方法

权利要求书

1.一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.样品前处理剂的制备：

样品前处理制剂由PH＝7.2的500mL细胞核裂解缓冲液和PH＝7.2的50mL染色缓冲液组成；

S2.待测材料取样

选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料，取实验材料时，用灭菌双蒸水反复冲洗干净，选择幼嫩部位，取样量480-510mg，取样时避开植物叶脉、维管束等代谢物含量多的组织；

S3.细胞核悬浮液的制备；

S4.仪器检测与对应荧光通道的质量控制；

S5.对照及标准流式细胞仪检测；

S6.数据比对及倍性确定：

(1)确保检测条件不变，以二倍体三叶木通的对照产生的DNA含量荧光强度分离峰为参照标准；

(2)更换需检测倍性的细胞核悬液，检测前机器反冲30min，确保无干扰，数据结果在BDAcuuriC6图区展示，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平；

(3)根据对照和待测样本分离峰位置的比值大小，确定倍性。

2.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S1中，细胞核裂解液缓冲液储存应在4℃恒温环境，使用染色缓冲液应采用相配现用原则，样品前处理制剂配置完成后过500目网筛。

3.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S1中，细胞核裂解缓冲液配方如下：

染色缓冲液配方如下：

4.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S3中，细胞核悬浮液的制备方法具体如下:

(1)将取样的材料放入灭菌的培养皿中，加入步骤S1中4℃预冷的细胞核裂解缓冲液2mL，纵横二个垂直方向快速切割组织，使细胞核释放出来,整个切割过程保证控制在2min内；

(2)吸取细胞核裂解缓冲液，用消毒灭菌后，用300-500目滤膜过滤，收集滤液，静置5min后，再次使用500目过滤，确保无大型杂质；

(3)将过滤后的细胞核悬液收集至无菌的2mL离心管中，加入20uL步骤S1中的染色缓冲液后,轻微震荡摇匀，4℃避光静置染色30min，得到流式细胞仪标准上样的单细胞核悬液。

5.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S4中，仪器检测与对应荧光通道的质量控制方法，具体如下:

(1)进行测定前,确保流式细胞仪自动清洗内部使管道畅通，喷嘴清洁,使用双蒸水，调节至高速冲洗30min，数据面板显示每秒单位进样量在10个以下，则可说明仪器清洁可上样检测；

(2)对荧光通路进行QC检测，采用流式细胞仪通用质控微球，运行参数设置：低速，收集数量50000个；如荧光强度最大的峰CV5％，则可进行上样检测。

6.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S5中，对照及标准流式细胞仪检测方法具体如下:

(1)控制样品进样速度为低速进样，各通道的变异系数CV稳定且在0～5％，控制细胞流速在20～120个/秒，以保持细胞核悬液分离纯度，最终检测个数设定10000个；

(2)设置已知倍性的三叶木通为对照材料，将对照材料细胞核悬液置于流式细胞仪测定，该仪器信号采用20mw，488nm的激光；通过与流式细胞仪相连的计算机分析软件，设置细胞检测阈值，设置FSC-A范围0-10万，SSC-A范围0-20万，去除大量非细胞核杂质，即可进行待测样品的倍性鉴定。

7.如权利要求1所述的一种高效的三叶木通倍性检测方法，其特征在于，步骤S6中，(3)根据对照和待测样本分离峰位置的比值大小，可分为以下几种情况：

①.对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标10w的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标10w±5％的位置时，该待测样品为二倍体；

②.当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标20w±5％的位置时，该待测样品为四倍体倍体；

③.当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标40w±5％的位置时，该待测样品为八倍体倍体；

④.当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定。