[发明专利]一种高效的三叶木通倍性检测方法

说明书

本发明公开了一种高效的三叶木通倍性检测方法，包括如下步骤：样品前处理剂的制备；待测材料取样：选择愈伤组织、下胚轴、子叶、悬浮培养细胞和叶片等材料，取实验材料时，用灭菌双蒸水反复冲洗干净，选择幼嫩部位，取样量480‑510mg，取样时避开植物叶脉、维管束等代谢物含量多的组织；细胞核悬浮液的制备；仪器检测与对应荧光通道的质量控制；对照及标准流式细胞仪检测；数据比对及倍性确定。本发明具有前处理步骤精简化、高效制备检测所需细胞核悬液、排除RNA干扰、标准化流式细胞仪上样参数、鉴定结果统一标准、多方法组合保障结果准确、检测规模化、结果可视化、数据传输便捷的优点。

技术领域

本发明涉及植株倍性检测技术领域，具体为一种高效的三叶木通倍性检测方法。

背景技术

三叶木通(Akebia trifoliata)是木通科木通属的一种多年生木质藤本植物，在中日韩三国相关研究发展迅速，研究领域涉及栽培技术、育种技术和分子基础研究等。早在1986年，我国学者蒋立科对其成熟果实的氨基酸进行分析，随后的研究中发现其富含游离氨基酸、齐墩果酸、黄酮和皂苷等，是一种新型食疗保健水果。2018年，我国四川省出台《四川省八月瓜食品安全地方标准》助推了三叶木通产业发展，其人工定植面积在四川省已累计7万余亩，相关深加工产业如果酒、果茶、果醋酸等也日趋成熟。但由于三叶木通种子含量多57-167粒/果，果肉可食率低至 18.70％-32.96％，导致其水果产业发展和产品加工受到了一定的限制，我国学者柳海宁、姜放军等人试通过倍性育种技术诱变野生二倍体三叶木通获得多倍体，期以多倍体的低稔性解决籽多、可食用率低的问题。但由于三叶木通传统倍性鉴定技术如染色体显带计数效率低下，且三叶木通分裂中期的染色体极度皱缩，形态呈现颗粒状或短棒状,大多数染色体上的C 带和G带不明显，致各别染色体的形态难以识辨，无法进行规模化鉴定，使三叶木通诱变育种进展相对滞后。因此，实现三叶木通倍性育种的快速发展，需提高鉴定方法的效率和结果的准确性。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是近几年在植物细胞计数、基因组大小测量、细胞周期分析等应用方面发展起来的植株倍性分析方法。对拥有大量样品的试验来说，是一种高效、经济、快捷的倍性检测方法。该方法可在很短时间内分析成千上万个细胞的倍性水平，与传统方法相比具有明显优势。其检测原理是荧光染料可定量嵌合在细胞核内DNA双链分子上，在一定的压力下染色细胞进入流式细胞仪的流动室，滤片收集到的每个细胞相应的荧光强度与细胞内的DNA含量成正比，以此来反应细胞核内DNA含量。目前，应用FCM进行植株倍性鉴定的成功应用较多，如黑麦、草莓、苜蓿、猕猴桃等。由于不同植物次生代谢物组成和含量不同，需要调节流式细胞术所需的细胞核裂解液、荧光染色液的配比、样品前处理步骤和上机参数等。至今为止，我国暂没有文献记载三叶木通相关的流式细胞术倍性鉴定的成功案例，仅2015年贵州大学石小兵曾采用此技术，但由于秋水仙术毒性作用以及三叶木通多酚含量较多的特性，导致鉴定结果中干扰峰强烈，结果不准确。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种高效的三叶木通倍性检测方法，以解决背景技术中提出的问题。该发明为实现三叶木通少籽、乃至无籽化，推动三叶木通倍性育种技术提供了一种高效、准确的倍性鉴定方法。国内外常用的化学诱变法需大量供试材料，传统的染色体计数法导致效率低下且受鉴定部位限制，并不能作为一种规模化的鉴定方式。以该研究探索的方法适用于三叶木通这一物种，使其鉴定不受部位、时间、技术限制，在保障结果准确性的同时可进行系统化、规模化鉴定。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种高效的三叶木通倍性检测方法，包括如下步骤：

S1.样品前处理剂的制备；

样品前处理制剂由PH＝7.2的500mL细胞核裂解缓冲液和PH＝7.2的50mL染色缓冲液组成；

S2.待测材料取样