[发明专利]基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法及其应用

权利要求书

1.一种非治疗目的的基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法，其特征在于，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入细胞内或小鼠体内，对机体本身存在的SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，进而增加全长SMN的mRNA与蛋白表达；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.一种针对机体本身存在的SMN2基因TSL2位点的sgRNA，其特征在于，其序列如SEQ IDNO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示。

3.一种质粒，其特征在于，所述质粒能表达出如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO. 3或SEQ ID NO. 4所示sgRNA。

4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自序列如SEQ ID NO. 28、SEQID NO. 29、SEQ ID NO. 30或SEQ ID NO. 31所示的质粒。

5.一种编辑的iPSC，其特征在于，其TSL2结构产生插入、缺失或插入和缺失；所述TSL2结构位于机体本身存在的SMN2基因7号外显子上。

6.根据权利要求5所述的编辑的iPSC，其特征在于，其在TSL2的茎环结构的茎部“ATTCCTT”或“AAGGAGT” 发生插入、缺失、插入和缺失。

7.根据权利要求5所述的编辑的iPSC，其特征在于，其TSL2位点包含序列为：GGTGCTCACATTAAGGAGTAAGTCTGC（SEQ ID NO. 26）或GGTGCTCACATTCCTTAAGGAGTAAGTCTGC（SEQ ID NO. 27）。

8.构建如权利要求5-7任一项所述的编辑的iPSC的方法，其特征在于，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入iPSC，对机体本身存在的SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其产生插入、缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，得到编辑的iPSC；所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述iPSC还可以是其衍生的神经上皮祖细胞、运动神经元祖细胞或运动神经元。

10.一种定向分化细胞，其特征在于，所述定向分化细胞为NEP、MNP或iMNs，所述定向分化细胞由如权利要求5-7任一项所述的编辑的iPSC定向分化得到。

11. 如SEQ ID NO. 1所示的SpsgRNA1、如SEQ ID NO. 2所示的SpsgRNA2、如SEQ IDNO. 3所示的SasgRNA3或如SEQ ID NO. 4所示的SasgRNA2，或如SEQ ID NO. 28、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31所示的质粒在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的试剂中的应用。