[发明专利]基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基于CRISPR增加SMN蛋白表达的方法，包括：构建特异性编辑TSL2位点的CRISPR基因编辑系统，该系统包括靶向TSL2位点的sgRNA和Cas9蛋白，或者是表达出靶向TSL2位点的特定sgRNA和Cas9蛋白的质粒或病毒载体；后将系统导入细胞内或小鼠体内，对SMN2基因7号外显子上的TSL2位点进行编辑，使其随机产生插入或缺失或插入和缺失，从而使TSL2结构破坏或不稳定，进而增加全长SMN的mRNA与蛋白表达。利用基因编辑技术精确编辑SMN2基因TSL2位点，编辑后的细胞能持续转录、翻译，蛋白增加的阳性克隆率达44％。

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9在基因水平精确缺失调控元件，从而提高SMN蛋白水平的方法及其应用。

背景技术

SMA是一类由于脊髓前角运动神经元变性导致的对称性肌无力和肌萎缩的神经肌肉疾病，是一种婴儿期最常见的常染色体隐性遗传性疾病之一，主要表现为肢体近端肌无力，随病情加重，躯体运动功能下降或丧失，出现吞咽和自主呼吸困难，最终因呼吸肌麻痹而死亡。SMA在人群中的发病率约为1/6000-1/10000。携带率为1/40～1/50^[1]，在我国人群携带率约为1/43^[2]。通常根据疾病严重程度及发病年龄主要将SMA分为5个亚型，其中SMA-I型约占50％，患者在出生时或在出生6个月内发病，全身严重肌无力，不能独坐，婴儿无法正常抬头，常在20个月之前由于呼吸肌麻痹导致死亡^[3]。SMA属于严重致死、致残的遗传性疾病，给患者家庭及社会都带来了巨大的负担。

SMA的致病基因是编码运动神经元存活蛋白(Survival Motor Neuron,SMN)的SMN1基因，人的SMN基因定位于5q11.2-5q13.3^[4]，且有两个高度同源的拷贝，靠近端粒端的称为SMN1/SMNt，而靠近着丝粒的称为SMN2/SMNc，二者在编码序列上仅相差1个碱基且编码相同的蛋白，在SMN1基因7号外显子第6位碱基为C，而SMN2为T，由于该碱基的不同，导致SMN2产生了选择性剪接，仅产生约10％左右的有活性的SMN蛋白^[5]。SMN2基因的缺失虽然不会致病，但临床统计表明SMN2拷贝数与疾病的严重程度成反比^[6]，而且几乎所有的SMA病人中都含有至少一个拷贝的SMN2基因，因而SMN2是SMA的理想治疗靶点。2005年Elizabeth发现，SMN蛋白“C端”氨基酸序列的特异性不重要，但必需具备一定的长度^[7]。SMN1基因的“C端”由7号外显子编码16个氨基酸，SMN2由于发生外显子跳跃，其“C端”则由8号外显子编码4个氨基酸，当用氨基糖甙类药物(G418)处理后，可使SMN2通读第1个终止密码子，SMN2的“C端”则可由8号外显子编码9个氨基酸。Christopher等发现用G418处理SMA I型患者的成纤维细胞可使SMN蛋白水平显著增加，且G418处理的SMA小鼠活动能力得到显著改善^[8]。构建通读的SMA模型小鼠，小鼠的存活时间大大延长^[9]。这些研究进一步说明SMN蛋白“C端”氨基酸序列并非特异但需具备一定的长度。