[发明专利]用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂及检测体系在审
| 申请号： | 202110639516.0 | 申请日： | 2021-06-08 |
| 公开（公告）号： | CN113337628A | 公开（公告）日： | 2021-09-03 |
| 发明（设计）人： | 郝海婷;冯宏祖;王兰;羊坚;谢伟 | 申请（专利权）人： | 塔里木大学;阿拉尔市铁漫植保服务有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6848;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京知呱呱知识产权代理有限公司 11577 | 代理人： | 杜立军 |
| 地址： | 843300 新疆维吾尔*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 检测 梨花 粉梨火 疫病 pcr 试剂 体系 | ||
1.一种用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂，其特征在于，所述检测试剂包括第一引物对和第二引物对，其中，所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的核苷酸序列如所示。
2.如权利要求1所述的用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂，其特征在于，
所述试剂还包括Super Mix。
3.一种利用权利要求1所述的巢式PCR试剂构建检测鸭梨花粉中梨花粉梨火疫病菌的检测体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将待测鸭梨花粉加入到PBS溶液中，恒温振荡1h，灭菌滤纸过滤，得到滤液；
将所述滤液分别加入7个离心管中，离心后，弃上清，再加入900μL无菌水悬浮沉淀，得到混合悬液；
分别向所述7个离心管中，对应加入7个浓度梯度的解淀粉欧文氏菌；
对所述7个浓度梯度的解淀粉欧文氏菌进行巢式PCR检测，确定巢式PCR检测的灵敏度。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述解淀粉欧文氏菌的7个浓度梯度为2.7×107CFU/ml、2.7×106CFU/ml、2.7×105CFU/ml、2.7×104CFU/ml、2.7×103CFU/ml、2.7×102CFU/ml、2.7×101CFU/ml。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述巢式PCR反应体系为菌液菌液/稀释产物1μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、Super Mix 12.5μL、ddH2O 10.5μL。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述离心管中加入1ml滤液，离心转速为13000rpm，离心时间为10min。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述巢式PCR中，第一轮PCR取1μL菌液为模板进行PCR扩增反应，扩增30个循环；
第二轮PCR时取稀释后的第一轮PCR产物1μL做为模板进行PCR扩增，扩增30个循环。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述巢式PCR检测的灵敏度为5CFU/Reaction。
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