[发明专利]用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂及检测体系

说明书

本发明公开了用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂及检测体系，所述检测试剂包括第一引物对和第二引物对，其中，所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的核苷酸序列如所示。本发明建立了梨花粉枝枯病菌高灵敏度检测巢式PCR体系，本发明利用巢式PCR分子方法建立高灵敏度的梨花粉枝枯病菌检测体系，确保商品梨花粉无菌安全，切断香梨枝枯病菌通过花粉传播扩散的途径。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测梨花粉梨火疫 病菌的巢式PCR试剂及检测方法。

背景技术

梨是严格异交授粉结实作物，近年来，新疆地区库尔勒香梨枝枯病防控形 势严峻，蜜蜂授粉受到限制，香梨产业受到严重威胁。无人机授粉是目前广推 的一种高效喷施授粉技术。然而，因为梨花粉病原物检验技术的缺失，使得 任何一种授粉方式在授粉过程中都存在传播病原物的安全隐患。

为了阻断病原物的传播，需要的对梨花粉中的病原物进行检测，从而去除 携带有病原物的花粉，目前缺乏有效的检测手段，检测梨花粉枝枯病菌，因而 亟待研发一种新的检测梨花粉枝枯病菌的体系及方法。

发明内容

为此，本发明提供用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂及检测体 系。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本实施例提供一种用于检测梨花粉梨火疫病菌的巢式PCR试剂，所述检 测试剂包括第一引物对和第二引物对，其中，所述第一引物对的上游引物的核 苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；下游引 物的核苷酸序列如所示。

优选地，所述试剂还包括Super Mix。

本发明实施例还提供一种利用所述的巢式PCR试剂构建检测鸭梨花粉中 梨花粉梨火疫病菌的检测体系的方法，所述方法包括以下步骤：

将待测鸭梨花粉加入到PBS溶液中，恒温振荡1h，灭菌滤纸过滤，得到 滤液；

将所述滤液分别加入7个离心管中，离心后，弃上清，再加入900μL无 菌水悬浮沉淀，得到混合悬液；

分别向所述7个离心管中，对应加入7个浓度梯度的解淀粉欧文氏菌；

对所述7个浓度梯度的解淀粉欧文氏菌进行巢式PCR检测，确定巢式PCR 检测的灵敏度。

优选地，所述解淀粉欧文氏菌的7个浓度梯度为2.7×10⁷CFU/ml、 2.7×10⁶CFU/ml、2.7×10⁵CFU/ml、2.7×10⁴CFU/ml、2.7×10³CFU/ml、 2.7×10²CFU/ml、2.7×10¹CFU/ml。

优选地，所述巢式PCR反应体系为菌液菌液/稀释产物1μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5μL、Super Mix 12.5μL、ddH₂O 10.5μL。

优选地，所述离心管中加入1ml滤液，离心转速为13000rpm，离心时 间为10min。

优选地，所述巢式PCR中，第一轮PCR取1μL菌液为模板进行PCR扩 增反应，扩增30个循环；

第二轮PCR时取稀释后的第一轮PCR产物1μL做为模板进行PCR扩增， 扩增30个循环。