[发明专利]一种促分化培养基及促进CD34阳性细胞分化为血小板的方法

说明书

本发明公开了一种促分化培养基及促进CD34阳性细胞分化为血小板的方法，该促分化培养基包括早期巨核细胞分化培养基、成熟巨核细胞分化培养基和血小板分化培养基；早期巨核细胞分化培养基是在StemSpansupgt;TM/supgt; SFEM II培养基中添加SCF、TPO、IL3、IL6和IL11；成熟巨核细胞分化培养基是在SFM培养基中添加SCF、TPO和IL11；所述的血小板分化培养基是在SFM培养基中添加TPO和IL11。本发明将脐带血CD34阳性细胞分化为巨核细胞及血小板，细胞的分化分为早期巨核细胞形成、成熟巨核细胞成熟和血小板分化三个阶段，在每个阶段使用对应的培养基与细胞因子组合，在体外可以得到高纯度的巨核细胞及功能性血小板。

技术领域

本发明涉及一种促分化培养基及促进CD34阳性细胞分化为血小板的方法。

背景技术

血小板，是从成熟巨核细胞胞质脱落下来的无核胞质小片，参与机体的凝血与止血过程，具有极为重要的生理学作用。血小板对于止血是必不可少的。血小板的产生障碍或功能缺失会导致各种出血并发症。由于血液学疾病或癌症化疗、放射治疗或造血干细胞移植等治疗方式会导致血小板减少；由于创伤、心脏手术、严重感染或高凝综合征造成的大量消耗也可能导致血小板减少。由于临床上的需要，大多数血小板是来源于志愿者捐献血液所得。血小板在体外保存的最适条件，是在室温条件不断搅拌可以储存5-7天，能较好地保持血小板的活性，以维持血小板的止血功能。

巨核细胞在体内是由骨髓造血干细胞分化而来的，是血小板的前体细胞，所占比例不到骨髓有核细胞的0.1％。巨核细胞在体外生成途径主要是由胚胎干细胞或多能干细胞分化而来，也可由脐带血中的造血干细胞生成。生产的途径主要是通过模仿体内分化为巨核细胞及成熟巨核细胞生成血小板的方式在体外产生。但是不同来源的多能干细胞产生巨核细胞的效率和比例均不相同，脐带血中的CD34阳性细胞是体外分化巨核细胞最直接和最接近的来源，所以在体外生成巨核细胞及血小板的效率应该最能接近体内巨核细胞及血小板的生成比例。

发明内容

本发明要解决的是优化脐带血CD34阳性细胞体外分化生成巨核细胞及血小板的分化方法，以提高巨核细胞及血小板的生成比例及数量。同时，体外分化的血小板在功能上要维持住凝血、聚集的基本功能，从而可以在体外产生足够数量的血小板用于临床治疗，以补充临床上短缺的功能性血小板。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种促分化培养基，包括早期巨核细胞分化培养基、成熟巨核细胞分化培养基和血小板分化培养基中的一种以上；

所述的早期巨核细胞分化培养基是在StemSpan^TM SFEM II培养基中添加50ng/mL人干细胞因子(SCF)、100ng/mL人血小板生成素(TPO)、20ng/mL人白细胞介素3(IL3)、50ng/mL人白细胞介素6(IL6)和20ng/mL人白细胞介素11(IL11)细胞因子；

所述的成熟巨核细胞分化培养基是在SFM培养基中添加20ng/mL SCF、50ng/mLTPO和20ng/mL IL11细胞因子；

所述的血小板分化培养基是在SFM培养基中添加50ng/mL TPO和10ng/mL IL11细胞因子。

上述的促分化培养基可以用于促进脐带血中CD34阳性细胞分化为血小板。

一种促进脐带血中CD34阳性细胞分化为血小板的方法，包括以下步骤：

(1)将CD34阳性细胞接种到早期巨核细胞分化培养基培养8天，期间换液若干次；

(2)在步骤(1)培养的第8天，吸取培养基接种到成熟巨核细胞分化培养基中培养，期间换液若干次；

(3)在培养的第14天，吸取培养基接种到血小板分化培养基培养，继续培养至少4天，期间换液若干次，得到血小板比例可观的分化产物；